DiD（CAS：127274-91-3），DiO（CAS：34215-57-1），DiI（CAS：41085-99-8），DiR（CAS：100068-60-8）和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，佳浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显：DiI(橙色荧光)，DiO(绿色荧光)，DiD(红色荧光)和 DiR (深红色荧光)这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发，有着比DiI更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

常见的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR，在被激发后形成不同颜色的荧光 (如图 1)。

图 1. DiO、DiI、DiD、DiR 光谱图

DiO 染色为例，简要抛出体外实验步骤

a）接种适量数目的细胞，37°C 培养过夜。

b）去除培养基，离心收集细胞，加入 PBS 洗涤 2-3 次，每次 5 分钟。

c）加入对应浓度 DiO 工作液 (5-10 μM)，室温孵育 30 分钟。

d）400 g，4℃ 离心 3-4 分钟，弃去上清。再次加入 PBS 洗涤细胞 2-3 次，以充分去除未进入细胞内的DiO。

f）用无血清培养基或 PBS 重悬细胞后，在荧光显微镜或流式细胞仪下检测。

图 2. 实验流程简图

DiO

DiO 为绿色荧光染料，激发/发射波长为 483/501 nM，DiO 常被用于正向或逆向示踪各类细胞或组织。(但相较其他三种染料，DiO 染料荧光强度较弱，对于某些固定的组织切片染色效果略差)。

Xin Li 等人研究了 CPCs (心脏祖细胞) 衍生的外泌体 (CPCs-Ex) 是否可以利用 mTOR 信号通路来减少病毒性心肌炎的细胞凋亡。研究人员用 DiO 对 CPCs-Ex 进行标记 (Dio 可通过选择性分割被纳入细胞膜)，评估 H9C2 细胞对 CPCs-Ex 的体外摄取，荧光显微镜观察发现 H9C2 细胞的每个细胞质均包含荧光信号 (图 2)，并减少 H9C2 细胞的凋亡，确定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染细胞中的抗凋亡作用。

DiI

DiI 为橙红色荧光染料，激发/发射波长为 551/569 nM，DiI 被用于正向或逆向示踪各类细胞或组织，荧光信号强度高于 DiO，在进入细胞膜时，其荧光信号会被大幅度放大。

如图 4 所示，Dil 染料标记外泌体，然后与目标细胞共培养。使用共聚焦显微镜捕捉 HOS 细胞对 Dil 标记外泌体的摄取，其中被标记的外泌体发出特异性橙红色荧光。

图 4. HOS 和 MG63 细胞摄取红色荧光染料 Dil 标记的 hBMSC-Exos[2]

DiD

DiD 为一种红色荧光染料，激发/发射波长为 646/663 nM，DiD 荧光信号高、不易淬灭、自身荧光干扰低，不仅用于细胞/组织染色，小动物活体成像中是常用的。

图 5. DiD 标记 EV-RBD 在小鼠体内分布情况亡[3]

DiR

DiR 是一种近红外染料，激发/发射波长为 754/778 nm，用于正向或逆向示踪各类细胞或组织，与 DiD 一样，DiR 自身荧光背景较低，也被用在活体成像中。