雾化吸入为mRNA-LNP提供了一种非侵入性、靶向肺部的高效递送策略。然而，雾化过程中产生的剪切力、界面张力及压力变化可能影响LNP的完整性与稳定性，进而改变其递送效率和安全性。本文结合北京元森凯德生物公司研制的雾化给药设备MicroSprayer Aerosolizer（型号：HY-LWH03，BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD）具体实验研究，系统介绍了吸入雾化过程中脂质纳米颗粒（LNP）粒径分布、表面电荷及mRNA包封率的表征方法，阐明其稳定性机制，为吸入型核酸纳米制剂的开发与质控提供技术参考。

（一）主要关键的仪器设备

1. 雾化给药设备

MicroSprayer Aerosolizer（型号：HY-LWH03，BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD）用于大/小鼠气管内雾化给药，产生可吸入气溶胶，控制粒径在1–5 µm 区间。

2. 粒径/电位/包封率表征

动态光散射仪（DLS）:测量LNP 的粒径、PDI 和 ζ 电位。

微量紫外-可见分光光度计 / RiboGreen 荧光法:测定mRNA 包封率（游离 vs 包载 mRNA）。

3. 体内成像与定量

小动物活体成像系统:实时捕捉Luciferase 或 tdTomato 荧光信号，评估器官分布与表达强度。

Living Image® 软件:用于ROI 圈选与荧光强度定量（p/s/cm²/sr）。

4. 分子与蛋白检测

Western blot 系统：检测FAH、dulaglutide、β-actin 等蛋白表达。

ELISA 读板机：测定血清中dulaglutide 蛋白浓度。

qPCR 仪：用于mRNA 合成后的纯度与完整性验证（补充方法常规步骤）。

5. 组织学与共聚焦成像

激光扫描共聚焦显微镜：观察肝切片tdTomato、FAH 免疫荧光共定位。

正置荧光显微镜：采集Sirius red 胶原染色图像，评估肝纤维化面积。

石蜡切片机+ 自动染色平台：制备H&E、Sirius red 切片。

6. 血清生化分析

全自动生化分析仪：测定ALT、AST、TBIL、UREA、CREA 等肝肾功能指标。

7. 辅助设备

超低温冰箱（–80 °C）、冷冻离心机（≥15 000 g）、超声水浴、脂质体挤出器：用于LNP 制备、分装与储存。

（二）实验步骤
脂质纳米颗粒（LNP）是目前mRNA递送的主流载体，其理化性质包括粒径、表面电荷和包封率，直接影响其在体内的分布、细胞摄取和表达效率。在吸入给药过程中，LNP需经历雾化、气溶胶化、沉积等多个动态阶段，这些过程可能破坏脂质双层结构，导致mRNA泄漏或颗粒聚集。因此，建立系统可靠的表征方法，明确雾化对LNP关键性质的影响，是确保吸入制剂有效性与安全性的关键环节。

一、粒径分布与多分散指数（PDI）的表征

方法原理
采用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）技术，通过检测颗粒在溶液中的布朗运动所引起的散射光波动，推算粒径大小与分布。多分散指数（PDI）用于评估体系的均一性，PDI<0.2通常表示体系分布较窄。

实验操作与数据分析

雾化前后分别取适量LNP样品，用缓冲液适当稀释后，注入比色皿，置于DLS仪中进行检测。

记录流体力学直径（Z-average size）与PDI值。若雾化后粒径变化在±5 nm以内，PDI仍低于0.2，可认为LNP在雾化中未发生显著聚集或破碎。

在研究中，无论是中性LNP（ALC-0315）还是带电LNP（含DOTAP/DOPG），粒径均保持在100–200 nm，PDI<0.2，表明雾化过程未破坏其结构完整性。

二、表面电荷（ζ电位）的测定

测定原理
ζ电位反映颗粒表面在溶液中的电性特征，影响其与生物膜的相互作用及体内稳定性。通常通过电泳光散射法测定。

关键步骤与结果解读

将LNP样品置于特定电泳池，在电场作用下颗粒发生迁移，仪器通过激光多普勒测速计算ζ电位。

雾化后，中性LNP的ζ电位应保持在−5至+5 mV范围内；带电LNP变化幅度应小于±2 mV。若结果符合，说明雾化过程中未引起脂质重组或表面电荷屏蔽。

例如，研究中DOTAP-LNP雾化后电位仍维持在正电位区间，DOPG-LNP保持负电位，表明表面电荷稳定。

三、mRNA包封率的准确评估

常用方法：RiboGreen荧光法
RiboGreen是一种高灵敏度荧光染料，可特异性地结合RNA。通过比较裂解前后LNP中mRNA的荧光信号，计算包封率。

操作流程

将样品分为两组：一组用Triton X-100等表面活性剂完全裂解，测得总mRNA含量；另一组不裂解，离心后取上清测游离mRNA。

包封率（%）=（总mRNA − 游离mRNA）/ 总mRNA × 100%。

研究显示雾化后包封率仍高于85%，部分达90%以上，说明雾化未引起mRNA明显泄漏。

辅助验证
微量紫外-可见分光光度法也可用于快速检测核酸浓度与纯度，但灵敏度不及荧光法，常作为RiboGreen法的补充。

四、综合分析与稳定性机制探讨

结构耐受性：粒径与PDI稳定反映LNP未融合或碎裂；ζ电位恒定说明表面化学组成未变；高包封率确认mRNA仍受保护。

稳定机制：优化配方中的PEG化脂质（如DMG-PEG2000）可在颗粒表面形成空间稳定层；温和的雾化设备（如YSKD Bio-TechMicroSprayer）减少机械应力；合理脂质组成（如DSPC与胆固醇）维持双层刚性，抵抗界面扰动。

五、展望
通过系统评估雾化前后LNP的粒径分布、表面电荷及mRNA包封率，可科学判断其吸入稳定性与工艺适应性。本研究基于DLS、ζ电位分析与RiboGreen荧光法等关键技术，证实了经优化的mRNA-LNP在雾化后仍保持结构完整与功能稳定，为吸入型核酸制剂的开发、质控及临床转化提供了可靠的表征策略与实验依据。未来可进一步结合透射电镜、体外气溶胶性能分析等多维度手段，完善吸入纳米制剂的综合评价体系。

参考文献：

①Nebulized Lipid Nanoparticles Deliver mRNA to the Liver forTreatment of Metabolic Diseases，pubs.acs.org/NanoLett (2025)

②Inhalable biomimetic polyunsaturated fatty acid-based nanoreactors for peroxynitrite augmented ferroptosis potentiate radiotherapy in lung cancer，Journal of Nanobiotechnology (2025)

附：北京元森凯德生物技术有限公司研制生产的动物雾化吸入给药仪器，主要包括大/小动物肺部气管直接递送装置（动物气道雾化针）、小动物雾化给药仪，动物口鼻吸入、仅鼻腔雾化/鼻脑给药器、全身式暴露染毒、动物烟气/PM2.5染毒系统、粉尘气溶胶发生器、液体气溶胶发生器、静式吸入染毒柜、臭氧动物暴露装置、动物高低压氧舱，此外给客户多样化提供自动型实验动物安乐处死系统（窒息系统、二氧化碳安乐处死箱），实验动物除臭暂存系统，巴马香猪皮，NGI Gentle Rocker智能洗盘装置，NGI新一代撞击器和ACI安德森撞击器的校验与检测。

部分用户案例：哈佛大学，麻省理工学院，新加坡国立大学，瑞士苏黎世联邦理工学院，清华大学，中国科学院上海药物研究所，中国中医科学院中药研究所，美国强生制药公司，丽珠医药集团股份有限公司，中国科学院动物研究所，中国科学院微生物研究所，康龙化成（宁波）生物医药有限公司，中日医院呼吸病学研究中心/中日友好临床医学研究所，北京中医药大学，中国药科大学，沈阳药科大学，复旦大学，浙江大学，四川大学，中南大学湘雅医学院等

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