关键词
GC-MS/MS，持久性有机污染物（POPs），灵敏度，PCDDs，PCDFs，确证分析，TSQ 9000，AEI 源，Dionex ASE 350 加速溶剂萃取仪
作者
Richard Law1，Cristian Cojocariu1，Paul Silcock1，Chiara Calaprice2，1Thermo Fisher Scientific，Runcorn，UK 2University of Liege，Belgium
研究目标
本研究测试了配备AEI 源的Thermo ScientificTM TSQTM 9000 三重四杆GC-MS/MS 系统分析PCDD/Fs 的效果，TSQ 9000 系统灵敏度高、数据重现性好，符合欧盟法规的定量要求。
研究简介
随着近年来气相色谱- 三重四杆质谱 （GC-MS/MS） 联用技术的不断发展，欧盟644/2017 和771/2017 法规允许使用GC-MS/MS 对食品和饲料中的多氯代二噁英 （PCDDs）、多氯代呋喃 （PCDFs）、二噁英类多氯联苯（dl-PCBs）等化合物进行确证分析，并控制其"（Maximum levels, MLs）”和“干预水平（Action levels, ALs）”。1,2气相色谱- 高分辨率质谱 （GC-HRMS）因其高分辨率和高灵敏度，得以从各种复杂基质干扰中分离出这些强毒性的二噁英化合物。相比而言，三重四杆气质联用仪 （GC-MS/MS） 的特点则在于其高选择性是通过“母离子—子离子”组成的特征离子对来实现的，GC-MS/MS 能够获取基本不含基质干扰的总离子流图 （TICs） 。
自欧盟法规在2014 年允许使用GC-MS/MS 分析二噁英以来，1 灵敏度往往成为显示GC-MS/MS 在实现（并符合监管要求）的二噁英及二噁英类物质确证分析的重要性能指标。除灵敏度外，常规分析中评价仪器性能还需要考虑其他因素，如：样品质量、溶剂体积、和进样量等，这些因素也将方法 （和系统）在常规环境分析中的适用性。 在本研究中，我们评估了配备新型AEI 离子源的 TSQ9000 三重四杆GC-MS/MS 系统分析溶剂标样和实际食品/ 饲料样品中 PCDD/Fs 的性能。本方法以EU 法规规定的1/5 的“（MLs）”为定量限（LOQs），充分显示其能满足常规分析中所需的灵敏度、选择性和稳定性。
实验方法及操作
实验样品
动物饲料样品、质控样品和空白样由列日大学（ University of Liege）提供。表1 列出了样品类型、质量和所允许的浓度 （ML） 4。仪器性能测试、标准曲线和定量使用EN:1948 的标准溶液 （惠灵顿实验室公司） 进行分析。
样品萃取
样品制备按照此文献描述的提取和净化方法进行。采用加速溶剂萃取技术结合离线多层酸性硅胶柱、PowerPrepTM 自动化系统 （FMS 公司） 和三段柱（多层ABN 硅胶、 碱性氧化铝、活性炭）的净化方法进行样品处理，样品终定容在10 μL 壬烷中。本实验使用的GC-MS/MS 系统为配备Thermo ScientificTM TRACETM1310 气相的TSQ 9000 三重四杆质谱仪。液体样品通过具有触底进样功能的Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH 自动进样器进样分析。用全氟三丁胺（PFTBA） 对质谱仪进行自动调谐和校正。质谱仪在选择反应监测（SRM） 模式下运行，通过AutoSRM 软件对标记的和未标记 PCDD/F 进行离子对
和碰撞能的优化。相关的气相和质谱条件详见表2 和附录 A。数据的采集、处理和报告使用Thermo ScientificTM ChromeleonTM （CDS） 变色龙软件进行。
表 1. 样品详情及其浓度许可“（MLs）”。
方法中分配给待测化合物的驻留时间长于同位素内标（进样内标和回收率标）。这是因为同位素标记的化合物在样品中通常的添加量比待测化合物高很多。本研究中，通过驻留时间优先分配，在确保内标物有足够的扫描时间的同时 ，使目标物分析拥有较高的灵敏度。所有 GC-MS/MS 和 GC-HRMS 的对比实验， 都是基于TSQ 9000 GC-MS/MS 上2 μL SSL 进样与 WatersTM Autospec PremierTM （Milford，USA）上5 μL PTV 进样的结果进行的。
表 2. GC 与 MS 条件
结果与讨论
色谱分析
TraceGOLD TG-Dioxin 色谱柱能分离TCDD/F （图1） ，并为PeCDD/F 的同分异构体实现了符合现行EU 标准的色谱分离 （图 2）。
然而，在实际样品测试中这种方法效果并不理想，因为真实样品的测定方法必须使用多个离子对 ，离子比率及响应因子要求也需要满足EU 标准。IDL 附近浓度水平的测量结果具有不确定性，很难满足这些标准。因此，定义方法的定量限 （LOQ） 更为合理。灵敏度仪器检测限 （IDLs） 通常可以用两种方法来确定: 通过计算信噪比，或用一系列重复进样的数据来进行统计学分析。在 GC-MS/MS 分析中，背景噪音通常很小，因此会使用
第二种计算方式。
图3 显示了在 TSQ 9000 GC-MS/MS 系统中通过对2，3，7，8-TCDD 溶剂标样进行重复进样 （n=8）得到的 IDL 表现，标样进样浓度相当于 柱上5 fg。
为了证明三重四杆质谱分析PCDD/Fs的性能，EU3 指导声明：
“单个化合物的定量限可以定义为...标准曲线上的浓度点，该浓度下测量值与基于整条标准曲线计算的平均相对响应因子之间的偏差需在可接受范围内（30%） 且稳定（要求在一系列样品分析的/后测量）。（LOQ的计算需考虑内标回收率和进样量）。”
考虑到欧盟的要求，如果分析方法能被认同，其定量限（LOQ）需要达到或低于食品或饲料ML 值的1/5。1，2同时也需要满足色谱分离度、离子比率偏差 （±15%）、离子对数量 （2）、和四杆分辨率 （等于或优于单位质量））1，2 的标准。
因此，需要有一个浓度低的标准品来实现标准曲线中低浓度的点。CSL （Extended Calibration/Low Level, 见表 3）标样被梯度稀释了两倍和四倍并分别加入到标准曲线中。LOQ 测定的相关标准品浓度见表3，TCDD/F 和PeCDD/F 的定量和定性离子对的图谱参见图4。由于毒性当量值（WHO-TEQ）通常表示为 pg/g 值，因此，表3 中报告的LOQ 值也是以 pg 表示的。基质样品的LOQ 是考虑TEFs和样品质量后计算得到的绝对量。
表 3. LOQ—柱上绝对量，单位为 pg，以粗体字表示。 LOQ 为工作曲线上的浓度点，且该浓度的离子比率 （IR）和响应因子 （RF）检测结果符合EU 要求（IR±15%，RF RSD<30%）。
图 4. 四氯代和五氯代二噁英和呋喃 LOQ （CSL/4）的色谱图实例，分别为第4 次和第61 次进样，居于一个分析序列的尾。图中数字标记为柱上绝对浓度。
标准曲线、稳定性和重现性
二噁英的定量分析是基于同位素稀释法，使用响应因子（RF）计算的。通过外标曲线确定平均相对相应因子（ARFs），再根据ARF 来对17 种有毒 PCDD/Fs 进行定量分析。对单个化合物，RFs 的相对标准差 （%RSD） 是通过测定八点工作曲线计算得出的。实测计算出的 %RSD 非常理想，数值在 1.8% 和7.3% 之间，远低于EU 1，2 和 EPA5 要求的15% 。（表 4）
表 4. 八点工作曲线计算出的响应因子（RF）和RF RSD。浓度范围也已标注。
我们还额外进行了 EN:1948 CSL/4 的标样分析，以评估仪器在分析不同批次样品时的性能。在整个为时两天的分析序列中（63 次进样，包括21 份基质样品，11份空白样品，和31 份标准品），所有化合物的响应因子和离子比率一直都符合EU 标准1 和EU 指引，3 轻松实现高灵敏度，满足方法的定量限（ LOQs）要求 （图 5 和6）。整个序列分析运行期间， 2，3，7，8-TCDD 的离子比率即使在低浓度（柱上20 fg） 也一直稳定的保持在±15% 范围内 （图 6a）。
图 6a. 2，3，7，8-TCDD 的两个离子对在整个工作曲线范围内 （0.01–80 pg/μL）的离子比率。
图 6b. 所有目标化合物在所有标样和两天分析中的离子比率。
如图所示，小/大IRs （蓝色箭头标出） 范围处在允许的±15% 公差 （橙色条） 之内。
实际样品中PCDD/Fs 的定量和确证分析
一个灵敏度足够高的分析系统使得用户在样品制备过程中更加灵活。表5 显示了草饲料基质样品的 LOQs （已通过样品质量和TEF 进行校准），以及所测QC 样品的污染值。结果表明，本方法具有较高的灵敏度，方法的LOQ 低于法规要求的五倍，意味着必要情况下分析人员可以仅使用5克饲料样本来完成分析 。
表 5. 饲料 QC 样品的计算 LOQs。
表 6. 样品分析结果。表中显示了各种饲料样品中特定化合物的毒性当量 pg/g 以及 上限和下限的总和等。
由于 GC-HRMS 和 TSQ 9000 系统之间存在 LOQ 差异，而许多样本中被检化合物的浓度水平又非常低，所以许多样本的检测结果都无法进行直接比较。但绵羊样品可以，因为其浓度在 ML 之上，而下限WHO-TEQ 正在上限WHOTEQ的20% 偏差之内 （0.2% 区别）。1 "QC- 猪油" 和 "QC- 饲料" 样品的分析结果与 GC-HRMS 测定的WHO-TEQ 结果吻合度较高（图 8 和9） 偏差分别为 + 1%和-18%。
我们发现 QC 样品中2，3，4，7，8-PeCDF 的分析结果在 GC HRMS 数据中较高；这可能是由于 GC-HRMS 分析中使用了5% 苯基型柱，造成另一 PeCDF 同分异构体的共洗脱。9 而TSQ 9000 GC-MS/MS 系统使用的是TraceGOLD TG-Dioxin 柱，能够实现所有同分异构体的完美分离。所有结果都相对程序空白样进行了校正。
结论
研究结果表明，配置了 AEI 源的 TSQ 9000 GC-MS/MS 系统满足欧盟标准对食品和饲料中二噁英检测与确证的所有现行要求。
• 在连续两天的分析中，配备AEI 源的TSQ 9000 GC-MS/MS 系统展现出较高的灵敏度、稳定性和重现性。本方法对低至 5 g 饲料样品的分析都是可行并符合法规的。
• 离子比率和响应因子的稳定性和可重现性为使低浓度样品的定量更为可信赖。
• 对ML 以下的低浓度样品，报告的 WHO-TEQ 上限结果显著低于1/5 ML 的要求，使得不同样品的分析具有更高的灵活性和真实性。
图 8. “QC – 猪油” WHO-TEQ （pg/g） 与 GC-HRMS 结果的比较
参考文献
附录 A
用于目标化合物定量和确证分析的选择离子监测 （SRM）离子对，及相应的碰撞能 （CEs） 。目标化合物的驻留时间优先设置为高，可以提高低定量限的灵敏度以及其离子比率的稳定性。
原创作者：赛默飞世尔科技（中国）有限公司
第8年
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