摘要：孕酮及其代谢物对女性具有重要作用，因此常用于激素替代疗法。然而目的研究表明，孕酮（合成孕酮）可在多种疾病中发挥重要作用，尤其是乳腺癌。本文介绍的安捷伦LC/MS/MS 方法采用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪和 6495 三重四杆液质联用系统，适用于分析孕酮及相关依赖性激素，其中包括孕酮、3α-/5α-/20α-二氢孕酮以及别孕烯醇酮、孕烯醇酮和脱氧皮质酮。
言：除雌激素外，孕酮及其代谢产物在乳腺癌的发展中发挥着重要作用，会增加乳腺癌的发生风险[1,2]。对乳腺组织和肿瘤乳腺组织的检查结果显示有三种孕酮代谢产物参与其中：3α-、5α- 和 20α-二氢孕酮[1,3]。除孕酮外，5α-二氢孕酮还具有促进乳腺癌发展的作用，而另外两种代谢产物 3α-和 20α-二氢孕酮则会抑制乳腺癌的发展[4]。到目为止，孕激素和孕酮已广泛用于激素替代疗法，但由于化学性质不同，其作用可能有所相同，可能引起负面的副作用[5]。本文开发的 LC/MS/MS 方法旨在用作一种分析男性和女性血清中激素水平的方式。
标样配制和校准曲线绘制所有分析物均溶于乙腈中。然后使用乙腈配制浓度为 1 mg/L 的混合物。配制 7 个浓度的标样，涵盖 5 ng/L–1 µg/L 的工作范围。将内标溶于乙腈中制成浓度为1 µg/L 的溶液。由于没有可用的市售质控品，故用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液进行配制。质控品的浓度涵盖标样组的中低浓度范围。
样品处理取等量标样、质控品或血清样品 (400 µL)，然后加入 50 µL 内标。向样品中加入 5 mLMTBE，用于提取孕酮代谢产物。然后，将样品涡旋混合，并在 4700 rpm 下离心5 分钟。转移有机上清液，在 45 °C 下用氮气吹干。用 600 µL 1 mol/L 羟胺溶液 (0.5% NaOH)复溶残留物，涡旋混合。在 90 °C 下进行衍生化反应，持续 15 分钟。反应期间，以500 rpm 的转速振摇溶液。冷却后，加入5 mL MTBE，涡旋混合物。离心后（5 分钟，4700 rpm），除去上清液，并在 45 °C下用氮气吹干。然后用 100 µL 水/乙腈(70%/30%) 复溶残留物，并转移至样品瓶中进行分析。
数据分析采用 Agilent MassHunter 采集软件(B.08.00) 进行数据采集。采用 AgilentMassHunter 定量分析软件 (B.08.00) 对数据进行分析。使用所用内标（孕酮-2,3,4-13C3）对所有分析物进行校正，以排除基质效应。
结果与讨论LC/MS/MS 方法能够分离所有孕酮代谢产物，如图 1 中的示例血清样品所示。异构体也可成功得到相关分离。
分析验证显示，分析内和分析间精度符合要求，所有数值均低于 10%。除定量限 (LOQ) 和线性数据外，精度数据如表 2所示。为检测 LC/MS/MS 方法，对男性和绝经后女性的血清样品进行处理和测定。两个性别相关孕酮的相关激素值和比值结果相似（表 3）。
结论本应用简报中介绍的 LC/MS/MS 方法可以测定孕酮及相关代谢产物。达到的LOQ 还有助于在自然孕酮水平较低的男性和绝经后女性中测定这些激素。需要注意的是，样品处理过程非常复杂，且会对测定结果产生影响；因此需要格外小心。孕酮和 20α-二氢孕酮的测定结果与文献值（括号中的值）相当：男性孕酮为48.2 ng/L (42 ng/L)，女性孕酮为 27.9 ng/L(34 ng/L)，男性 20α-二氢孕酮为 58.3 ng/L(39 ng/L)，女性 20α-二氢孕酮为 40 ng/L(40 ng/L)。同样，5α- 和 3α-二氢孕酮之间的比值与文献值十分相近（10.9 与 9）[4]。文献中 3α- 和 5α-二氢孕酮的比值明显较高，可能是由于使用了另一种内标[4,6]。
