引言：传统检测单糖、双糖的分析方法有化学法、光谱法、GCMS、HPLC等方法。其中化学法无法准确测定单种糖的含量；光谱法的工作繁琐、误差比较大；GC-MS方法需要进行衍生化反应，前处理复杂，不利于快速分析；HPLC法虽然相比其他方法灵敏度好、检测速度快、适用范围广，但也存在检出限较低、抗干扰能力差，尤其对于食品中低浓度的单糖、双糖很难进行测定，无法满足现阶段对食品检测快速、灵敏、准确的要求。LCMS/MS技术通过质谱的高选择性和高灵敏度能够降低目标物的检出限、提高检测的重现性。由于糖类为水溶性化合物，在常规的C18色谱柱上没有保留，而采用其他填料的亲水色谱柱也很难得到太好的峰形或分离度。因此，选取一款合适的分析糖的色谱柱是液质分析糖的实验关键点。目前专门测试糖的糖柱通常为液相柱，需要用到100%纯水相来作为流动相，并且流速通常高于1 mL/min，这样的色谱条件对于大多数的质谱离子源来说都无法实现化合物的有效离子化，或者只有通过分流才能实现，但是分流后将损失仪器的检测灵敏度，失去了使用液质联用仪测试糖的提高灵敏度的目的。 SCIEX 的LC-MS/MS液质联用系统的一大特点就是强大的 TurboV™离子源技术，离子源的加热能够达到750℃，ESI源耐受流速范围 5 µL/min～3.0 mL/min，APCI源耐受流速范围50 µL/ min～3.0 mL/ min，因此可以直接使用HPLC糖柱在SCIEX液质联用仪上进行测试，即实现了好的分离效果，又提高了检测灵敏度。本实验使用SCIEX Triple Quad™ 4500 质谱系统同时测定梨中的葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇四种糖, 实验方法简单、灵敏度高、选择性好。
实验思路 1. 配制果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇标准曲线，测试四种水溶性糖的低检出限； 2. 测试砀山酥梨果实中四种水溶性糖的含量，了解梨中四种糖的比例关系。
样品处理 1．移取果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇标准品，用纯水稀释，配制成 50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 µg/mL、5 µg/mL 和 10 µg/mL 的标准溶液。 2．梨果实中可溶性糖的提取。
梨果实中糖的提取材料：砀山酥梨（采集于南京农业大学江浦园艺实验站）将样品去皮削成小块，液氮速冻后储存于-80冰箱。称取2g样品，加液氮研磨后，加入80%乙醇7 mL混匀。在37℃水浴中恒温 30 min，超声提取15 min，10000 r/min离心15 min。将上清液移入25 mL容量瓶。重复提取3次，最后加入80%乙醇定容至25 mL。取2 mL溶液旋转蒸发，用1 mL水溶解蒸干后的固体，溶解时用超声波处理，尽量溶解完全。溶液离心后，用0.22 µm水系滤膜处理，即可用于测定。实验过程中发现此前处理过程提取出的糖样品在液质仪器上的响应信号过高，最终样品又用纯水稀释10倍和1000倍分别上机测试。
色谱方法色谱柱：Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm；流动相：100%纯水洗脱流速：1 mL/min； 柱温：85℃；进样量：10 µL
质谱方法 SCIEX Triple Quad™ 4500 质谱系统 扫描方式：MRM采集方式离子源：APCI Negative 离子源参数 CUR：气帘气 25.00 psi NC：离子化电流 -2.00 uA TEM：加热温度 400.00 ℃ GS1：喷雾气 75psi CAD：碰撞气 Medium
扫描方式：MRM采集方式离子源：APCI Negative 离子源参数 CUR：气帘气 25.00 psi NC：离子化电流 -2.00 uA TEM：加热温度 400.00 ℃ GS1：喷雾气 75psi CAD：碰撞气 Medium
结果与讨论 ：1、色谱条件的选择本实验选择使用液相糖分析柱Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm， 1 mL/min 纯水流动相，对果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四种糖进行分离，其中果糖和葡萄糖为同分异构体，用该色谱柱可以得到很好的分离，每种化合物的峰形都很对称，峰形较
3、样品提取条件的优化本实验中样品提取过程基于以前使用液相检测时的灵敏度而开发，因此在用80%乙醇水对样品提取之后，通过旋转蒸发再用纯水复溶的过程将80%乙醇水溶剂替换成纯水。而采用液质联用技术方法检测灵敏度比液相提高1000倍以上，样品浓度无需过高，因此在原有的提取步骤之后，只需用纯水将样品稀释10倍以上，过滤膜即可上机测试。既可以降低样品的基质效应，又大大缩短了样品前处理所需时间。
……
总结：本实验通过SCIEX LC-MS/MS技术同时检测了果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四种可溶性糖，实验中测试了不同的色谱柱对灵敏度的影响，最终选择了HPLC糖柱来分析。利用了SCIEX Turbo V™ 离子源强大的耐高流速的特点，在SCIEX Triple Quad™ 4500系统上直接使用了HPLC色谱条件，100%纯水1mL/min流速下做液质分析，依然得到了良好的检测灵敏度。方法的定量限≤50ng/mL。以砀山酥梨为样品进行了可溶性糖的提取前处理，用该液质方法进行糖含量检测，检测结果显示经过不同时间的栽培处理梨中糖分含量差异很大，以含糖量高时的梨样品为例，推算出此时1个梨果实中约含果糖12g、葡萄糖7g、蔗糖7g、山梨醇32g。 SCIEX LC-MS/MS系统具有稳定耐用易维护，灵敏度高和重现性好等特点，Turbo V™离子源技术使质谱检测耐受不同的液相流速，方法建立和开发更加简便，即使是HPLC的高流速纯水方法依然能够得到很好的检测效果。
