摘要 ：治疗性多肽和蛋白质的表征及杂质分析需要联合使用色谱分离和质量选择检 测。然而，多肽和蛋白质的色谱分离方法通常使用 MS 不兼容的流动相。本 应用简报采用多中心切割 (MHC) 二维液相色谱 (2D-LC) 作为质量选择检测 的自动脱盐工具。在第一维中，使用 MS 不兼容的流动相根据 USP 39 分析 多肽胰高血糖素。然后在第二维中进行自动脱盐和质量选择检测。
前言 在药物研究和开发中，治疗性多肽和 蛋白质受到了越来越多的关注。这些 大分子的复杂结构和杂质谱为其表征 和杂质分析带来了难题。要解决这些 难题，需要联用色谱分离和质量选择 检测 (MSD) 来分析上述分子1 。多肽 和蛋白质的色谱分离方法通常使用 MS 不兼容的流动相，例如含有高浓 度盐或非挥发性缓冲液的流动相1,2。 为了使这些色谱方法能够使用 MS 检 测，通常需要将方法转换为 MS 兼容 的流动相或收集馏分脱盐后进行离线 MS 分析1 。 在二维液相色谱 (2D-LC) 中，第二 维可作为有效的脱盐工具，从而实 现使用 MS 不兼容流动相的色谱方 法与 MS 检测的在线联用1 。配置二 维液相色谱软件 A.01.04 的 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案为 使用安捷伦单四极杆质谱仪的 MSD 联 用 2D-LC 提供了从方法设置到数据分 析的完全集成的解决方案。分流阀可 在每次第二维 (2 D) 运行开始时自动将 第一维 (1 D) 流动相中的盐或缓冲液分 流至废液。Agilent AdvanceBio 脱盐 反相小柱可用于在第二维中进行快速 有效脱盐，如之前的应用简报所述3 。 除了脱盐之外，当使用的标准长度色 谱柱和条件可提供与第一维分离不同 的选择性时，还可在第二维中实现进 一步分离2 。 胰高血糖素是一种含有 29 种氨基酸 的多肽类激素，用于低血糖的紧急治 疗4 。根据 USP 39，在流动相中使用 磷酸钾缓冲液，通过 LC 结合 UV 检测 进行胰高血糖素的有机杂质分析5 。而这与 MS 检测不兼容。本应用简报采 用多中心切割 (MHC) 2D-LC，在第一 维中根据 USP 39 进行胰高血糖素分 析，在第二维中进行自动脱盐和 MSD 检测。
实验部分 设备 Agilent InfinityLab 2D-LC 解决方案包 括以下模块： • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高速 泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备冷 却装置（选件 #100） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱 温箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity II 可变波长检 测器 (G7114B)，配备标准流通池 （部件号 G1314-60186） • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备 2 位/4 通双向阀 头（二维液相色谱阀 1300 bar： 部件号 5067-4244） • 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备带 40 µL 定量环 的多中心切割阀（部件号 G4242- 64000） • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备 2 位/6 通阀 800 bar（部件号 5067-4282） 质量选择检测采用配备安捷伦喷射流电 喷雾离子源（部件号 G1958-65538） 的 Agilent 6150 单四极杆液质联用仪 (G6150BA) 进行。
软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版，版本 C.01.07 SR3 [465] 以及二维 液相色谱软件，版本 A.01.04。 色谱柱 • Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，3.0 × 150 mm, 3.5 µm （部件号 959963-302） • Agilent AdvanceBio 脱盐反相 小柱，2.1 × 12.5 mm（部件号 PL1612-1102），带小柱柱套 （部件号 820999 901） 化学品 所有试剂纯度均为液相色谱级。乙腈 购自 Merck (Darmstadt, Germany)。 新制超纯水来自配置 0.22 µm 膜式终 端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统 (Millipak, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。磷酸二氢钾、 甲酸和胰高血糖素（合成粉末，经过 细胞培养测试）购自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。盐酸和 磷酸分别购自 Merck (Darmstadt, Germany) 和 J.T.Baker (Deventer, Netherlands)。
样品 将胰高血糖素复溶于 0.01 mol/L HCl 中 配制成浓度约为 0.5 mg/mL 的胰高血 糖素标准溶液。按照 USP 39 说明5 配 制胰高血糖素系统适用性溶液，将约 0.5 mg/mL 胰高血糖素的 0.01 mol/L HCl 溶液在 50 ºC 下保存 48 小时。
结果与讨论 ：根据 USP 39，在流动相中使用磷酸 钾缓冲液，通过 LC 结合 UV 检测进 行胰高血糖素的有机杂质分析5 。而这 与 MS 检测不兼容。多中心切割二维液相色谱使用第二维作为有效脱盐工 具，从而可将此液相色谱方法与质谱 检测在线联用。配置二维液相色谱软 件 A.01.04 的 Agilent InfinityLab 二维 液相色谱解决方案为使用安捷伦单四 极杆质谱仪的 MSD 联用 2D-LC 提供了完全集成的解决方案。为了便于在 MS 检测前进行脱盐，在每次第二维 ( 2 D) 运行开始时使用分流阀自动将第 一维 (1 D) 流动相中的盐或缓冲液分流 至废液
