摘要：啤酒是一种成分非常复杂的酒精饮料，以水、大麦芽或小麦芽为主要原料，并添加啤酒花酿造而成。啤酒花中的 a-酸在麦汁煮沸的过程中形成异-a酸，异-a-酸是啤酒典型苦味的主要来源。本应用简报展示了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对不同类型的啤酒进行全二维液相色谱分析。分别在第yi维碱性与第二维酸性 pH 值条件下使用 C18 色谱柱获得了良好的正交性。通过与标准物质进行对比分析及质谱检测，鉴定出啤酒中的苦味化合物。非靶向多样品分析（指纹图谱分析）能够对所分析的不同啤酒类型进行分类。
前言：啤酒是由淀粉糖化，再经淀粉水解糖发酵酿造而成的一种酒精饮料。其主要原料是水、大麦芽或小麦芽以及啤酒花1,2。啤酒加工阶段包括麦芽制造、酿造、发酵与成熟。啤酒中含有超过 800 种有机化合物，其成分非常复杂。不同啤酒之所以风味各异，主要是由于水中矿物质含量、原料类型以及酿造方法不同。啤酒有两种典型的发酵方式：顶部发酵（如爱尔啤酒与德国小麦啤酒）与底部发酵（如拉格啤酒与德国皮尔森啤酒）1 。在麦汁煮沸过程中添加啤酒花 (Humulus lupulus L) 穗、啤酒花颗粒或其提取物获得啤酒苦味。啤酒花中含有 a-酸（葎草酮）与 b-酸（蛇麻酮），它们主要以 n-、co- 和 ad-同系物形式存在。在麦汁煮沸过程中，几乎无味的啤酒花 a-酸转换成异-a酸（异葎草酮），后者赋予了典型的啤酒苦味与啤酒泡沫稳定性。异-a-酸具有光敏性，光照会导致异味的形成（日光嗅）3-5。因此，还原的异-a-酸（例如四氢异-a-酸）用于酿造业以提高啤酒的光稳定性与泡沫稳定性。德国啤酒纯净法 禁止添加还原的异a-酸，该法规定只能使用天然酒花化合物4 。使用配备紫外 (UV) 或质谱 (MS) 检测的高效液相色谱 (HPLC) 可对啤酒花产品中的 a-酸与 b-酸以及啤酒中的异-a-酸与还原的异-a-酸进行分析3-5。之前的应用简报介绍了对异-a-酸和还原的异-a-酸进行定量分析6 。
除 a-酸与 b-酸之外，啤酒花中还有多种多酚化合物，其中某些多酚化合物增添了典型的啤酒苦味。最重要的多酚化合物是黄腐酚相关的异戊二烯类黄酮，例如黄腐酚、异黄腐酚与去甲基黄腐酚3,5。图 1 展示了异-a-酸与还原的异-a酸，以及黄腐酚相关的异戊二烯类黄酮的结构。由于啤酒成分非常复杂，而全二维液相色谱（全 2D-LC）因其固有的高峰容量，非常适用于对啤酒进行全面分析。本应用简报展示了通过对不同类型啤酒进行指纹图谱分析，进而可以对所分析的啤酒样品进行分类。
实验部分设备安捷伦 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案包括以下模块：
• 两个 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226A)，配有 Agilent 1290 Infinity 恒温器 (G1330B) • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，带 2 位/4 通双向阀（二维液相色谱阀头，1200 bar（部件号 5067-4214），配备两个 60 µL 定量环） • Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器 (G4212A)，配备 60 mm 最大光强卡套式流通池 (G4212-60007)
使用配备安捷伦喷射流电喷雾离子源 (G1958-65538) 的 Agilent 6530 质量数 Q-TOF LC/MS 系统进行质谱检测。
软件 • Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版，版本 C.01.06 [61] 以及 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱采集软件，产品版本 A.01.01 [26] • Agilent MassHunter 工作站软件，用于 Agilent 6200 系列 TOF/ 6500 系列 Q-TOF 的 LC/MS 数据采集，版本 B.05.01，定性分析版本 B.06.00 • 用于二维液相色谱数据分析的 GC Image LCxLC-HRMS 版软件来自 GC Image LLC., Lincoln, NE, USA 色谱柱第yi维 Agilent ZORBAX Extend-C18 窄径 RR 柱，2.1 × 100 mm, 3.5 µm（部件号 761753-902）第二维 Agilent Poroshell HPH-C18, 4.6 × 50 mm, 2.7 µm（部件号 699975-702 化学品所有试剂纯度均为液相色谱级。乙腈和乙醇购自 Merck (Darmstadt, Germany)。新制超纯水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统 (Millipak, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。 DCHA-ISO、ICS-I3（由反式-异-a酸的二环己胺盐纯化制备）与 Tetra ICS-T2（由同时含有顺式 与反式异构体的四氢异-a-酸纯化制备）均购自 Labor Veritas AG (Zurich, Switzerland)。乙酸铵购自 Sigma Aldrich (Steinheim, Germany)，氨水购自 Merck (Darmstadt, Germany)。甲酸来自安捷伦（部件号 G2453-85060）。
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结论本应用简报展示了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对不同类型的啤酒进行全二维液相色谱分析。分别在第yi维碱性与第二维酸性 pH 值条件下使用 C18 色谱柱，可获得良好的正交性。根据标样的对比分析与 MS 检测，对啤酒苦味化合物（异-a-酸与还原的异-a-酸）进行鉴定。使用 LCxLC 软件进行非靶向多样品分析，随后进行主成分分析，可对所分析的不同类型啤酒进行分类。
