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使用Cary 3500 紫外-可见分光光度计为热熔实验提供更快的升温速率
点击次数：3112 发布时间：2020/9/6 10:14:23
前言： 升高温度可诱导双链核酸分离为单链。在一定温度下，碱基对之间的氢键发生断 裂。热熔实验利用了腺嘌呤-胸腺嘧啶 (A=T) 与鸟嘌呤-胞嘧啶 (GΞC) 核苷酸之间氢键 数的差异。由于 GΞC 核苷酸含有三个氢键，解离所需热能大于 A=T 对所需的热能。 这表示含有更多 GΞC 对的 DNA 要在更高的温度下才能熔解。熔解温度 (Tm) 可指示 样品中的碱基组成（GΞC 与 A=T 的比例）。制造商和研究人员常将 Tm 用作 QC 校验 指标。 使用紫外-可见分光光度法测定熔点，利用的是单链核酸在 260 nm 处的吸光度高 于双链核酸的原理。图 1 显示了使用小干扰 RNA (siRNA) 样品的示例，与 25 °C 相 比，85 °C 下 260 nm 处的吸光度明显更高。
通常通过测定 260 nm 处的吸光度来进行热熔实验。然后在 受控 pH 和离子强度条件下逐渐升高样品温度。通常以每分钟 0.5 °C 的速率升温（1、2、3）。需要非常慢的升温速率才能确 保准确且可重现的数据。然而，缓慢的升温速率也意味着实验 需要很长时间。例如，以每分钟 0.5 °C 的速率将温度从 20 °C 升至 95 °C 需要 2.5 小时。实验室通常需要重复这些测量以确 保可重现的结果，因此完整的热熔实验可能十分耗时。 有很多方法可以缩短热熔测量所需时间。例如，一些仪器能够 将实验分成几个阶段，每个阶段使用不同的升温速率。可以在 开始和结束阶段使用快速升温速率，在样品变性的温度范围内 使用较慢的升温速率。 分光光度仪器的最新进展大大缩短了热熔测量所需的时间，温 度精度比以往更高。Agilent Cary 3500 多区控温紫外-可见分 光光度计使用集成的比色皿内温度探头，可在实验过程中准确 控制溶液温度。多池支架内置于仪器中，使用无水风冷的帕尔 帖系统，在 0–110 °C 范围内控制样品温度。 本研究使用 Cary 3500 多区控温紫外-可见分光光度计评估升 温速率对 siRNA 样品熔解温度 (Tm) 计算值的影响。
实验部分：样品 siRNA 样品由安捷伦核酸解决方案事业部提供。使用含 100 mmol/L NaCl、0.1 nmol/L EDTA 和 10 mmol/L 磷酸钠的缓 冲溶液配制 ≈ 0.3 mg/mL 的 siRNA 溶液，调节至 pH 7.0。 使用标准 3.5 mL 体积、10 mm 光程的石英比色皿。使用纯磷 酸盐缓冲液作为参比溶液。 仪器和方法 所有测量均采用 Cary 3500 多区控温紫外-可见分光光度计。 方法参数如表 1 所示。 研究期间改变的唯一参数是升温速率。共使用了八个升温速 率：0.5、1、5、10、15、20、25 和 30 °C/min。 所有测量均使用至少三个平行样品在相同条件下同步进行测 量。将每个样品比色皿与参比样配对放置在八位多池支架 中。将比色皿内温度探头插入每个样品比色皿中（图 2），该 探头可用于控制实验温度。 每 0.5 °C 采集一次数据，在记录每个数据点之前将信号平均 1 秒。在每分钟 30 °C 的升温速率下，测量花费约五分钟。 对于上述检测，将搅拌速率设定为 500 rpm，以确保整个比色 皿内的温度足够均一。
结果与讨论 不同升温速率下的 Tm 值 在 8 个升温速率下采集的吸光度数据如图 3 所示。将数据归 一化为 0 到 1 个吸光度单位，叠加以便观察。计算每个一阶 导数并列出。由每个一阶导数图的最大峰值确定熔解曲线的中 点，从而确定 Tm 值。
结论 采用 Cary 3500 多区控温紫外-可见分光光度计以八个不同 的升温速率测量同一个 siRNA 样品的熔点。各个升温速率下 测得的熔点误差均在 ±1°C 范围内，表示实验室可以使用比 0.5 °C/min 的常规方案更快的升温速率。使用更快的升温速率 可以在不影响结果的前提下大大缩短实验时间。本研究表明， 使用 Cary 3500 可以在约 5 分钟内测定之前需要 2.5 小时才能 完成的实验。至少同步进行三次重复测定同样能够大大节省分 析时间。 使用较快的升温速率可扩展到其他紫外-可见吸光度随温度变 化的测量，为进行控温实验的实验室提供了显著的分析效率优 势。能够同步测量所有八个比色皿位置，进一步提升了致力于 研究液体样品对温度变化响应的实验室的分析效率。
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