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使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱 系统自动化柱前衍生功能实现伏马毒 素 FB1 和 FB2 的高通量检测
点击次数：2781 发布时间：2020/9/2 21:11:47
摘要 ：本方法使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统开发出一种用于测定伏马毒素的自动化柱 前衍生高通量液相色谱检测方法，并从灵敏度、重现性和线性范围三个方面对该方法的性 能进行了考察。该方法利用自动进样器程序进样功能、自动吸取 OPA 衍生试剂和样品， 避免了传统柱前衍生过程中人为量取、混合和等待等繁琐操作以及随之引入的误差，确 保了批次间实验结果的重现性，有助于实现伏马毒素的高通量检测。通过该方法，FB1 和 FB2 的检测限可达 300 pg/mL 左右，定量限可达 1 ng/mL 左右，保留时间 RSD% 均小于 0.2%， 10–2500 ng/mL 范围内有良好的线性相关性，相关系数均大于 0.9999。
简介 伏马毒素 (FUM) 是一种强毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小 麦、大米等粮食作物中，对动物和人的健康有很大的潜在危害[1]。 1993 年，伏马毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为 2B 类 致癌物（即人类可能致癌物）[2]。 目前发现的伏马毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、 FC2、FC3、FC4 和 FP1 等 11 种，其中主要组分为 FB1，已成 为继黄曲霉毒素之后的又一研究热点。目前，我国对伏马毒素尚 无明确的限量规定，但许多组织、国家已对伏马毒素制订了限 量标准。欧盟对伏马毒素（FB1 和 FB2）的总量规定玉米中限量 为 4 mg/kg[3]；瑞士规定人类食物中伏马毒素限量为 1 mg/kg[4]； 美国 FDA 规定以玉米为原料的食品中 FB 的最大限量为 2–4 mg/kg， 动物食品为 5–100 mg/kg[5]。
我国颁布的食品安全国家标准中，伏马毒素的液相色谱检测方法 包括柱后衍生和柱前衍生两种[3]。柱后衍生方法分析时间较长， 且仪器配置除了一台液相色谱外，还需要一套柱后衍生系统。而 柱前衍生方法步骤又非常繁琐，需要先用移液器分别移取 100 µL 样品和衍生试剂，再加入样品瓶涡旋约 30 秒，并在 2 分钟内进 样分析，整个衍生时间需要人为控制。而且，为了保证衍生反应 时间一致，必须完成一针进样后才能做下一个样品前处理，整个 过程需要操作人员全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016 食品安全国家标准 食品中伏马毒 素的测定》[6] 中规定的柱前衍生方案的基础上，运用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统的程序进样功能，开发出一种自动化柱前 衍生的高通量快速分析方法。该方法无需额外配置设备，无需人 员值守，具有良好的重现性，而且定量限和检测限指标完全满足 各项主要法规的要求。
实验部分 仪器和设备 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统，配备如下安捷伦组件： – Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件号 G7111B） – Agilent 1260 Infinity 标准自动进样器（部件号 G7129B） – Agilent 1260 Infinity 柱温箱（部件号 G7116A） – Agilent 1260 Infinity 荧光检测器（部件号 G7121B），配备标准检 测池 (8 µL) 标样配制 将伏马毒素 FB1 和 FB2 标准混合储备液用乙腈/水 (50%/50%) 逐级 稀释为 2500、500、250、125、75、25 和 10 ng/mL，分别对应 于浓度级别 7、6、5、4、3、2、1。 表 1. 标样配制 级别 1 2 3 4 5 6 7 浓度 ng/mL 10 25 75 125 250 500 2500 自动衍生步骤 硼砂溶液和衍生试剂参照《食品安全国家标准 食品中伏马毒素的 测定》中第三法的规定进行配制。 硼砂溶液 (0.1 mol/L)：称取硼砂 3.8 g，用水溶解并稀释至 100 mL，混合均匀。取该溶液 1 mL 置于 2 mL 样品瓶中，放在 自动进样器的 P1-A1 位置。 衍生试剂：准确称取 40 mg 邻苯二甲醛，溶于 1 mL 甲醇中，用 5 mL 硼砂溶液进行稀释，并加入 50 μL 2-巯基乙醇，混合均匀。 取该溶液 100 μL 置于 250 μL 内插管中，然后将内插管放入 2 mL 棕色样品瓶中，放在自动进样器的 P1-A2 位置。剩余衍生试剂放 入 –20 °C 冰箱中冷藏，1 周内使用未发现异常。
色谱条件 色谱柱 Zorbax RRHD Plus C18, 3.0 × 50 mm, 1.8 μm 柱温 40 ºC 进样量 4 μL（自动进样器自动衍生） 流动相 A 相：10 mmol/L KH2PO4，pH 2.3（H3PO4 调节） B 相：MeOH/ACN (50%/50%) 流速： 0.8 mL/min 荧光检测器 激发波长：335，发射波长：440， PMT 增益：12，采样频率：9.26 Hz 梯度时间表 时间 (min) B% 0 50 3 70 6 70 6.1 50 9 50
结论 本研究使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统的程序进样功 能，对伏马毒素 FB1 和 FB2 进行自动衍生，可有效防止 FB1 和 FB2 衍生产物的降解。与国家标准方法相比，该方法可大幅提高 检测效率，降低实验室人工成本。并且该方法具有非常良好的灵 敏度、线性和重现性，检测结果可靠，是一种非常适合于大批量 样品高通量分析的方法。
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