摘要：建立了高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中氯霉素浓度的方法。方法采用3通道MRM模式对氯霉素进行检测，一个通道用于定性，两个用于定量。分析方法的定量下限为0.02 ppb，定量线性范围为0.02 ppb-1.0 ppb，R2 = 0.9980，权重为1/X。
前言：氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，最早使用于1949年。氯霉素虽然价格便宜,但因其副作用大，故已不作为治疗人类疾病的一线药物[2,3] 。据报道，氯霉素能抑制骨髓细胞的生长，导致非再生性贫血和可能致命的再生障碍性贫血。此外，氯霉素是一种有效的非竞争性的微粒体酶抑制剂，能影响其它药物的吸收代谢。氯霉素也可当兽药应用,但由于它对人类有许多潜在的副作用，所以在许多国家被限制或禁止使用。欧盟2003/181/EC 决议规定在牛奶中被检出任何水平的氯霉素都是不允许的，同时规定检测氯霉素的方法必须符合或优于0.3 ppb的最低要求 [4] 。
实验样品制备氯霉素（CAP），纯度98%，购自Sigma-Aldrich；氯霉素-d5 (d5-CAP)，(溶于乙腈，浓度为100 μg/mL)，由剑桥大学同位素实验室提供。空白牛奶基质根据Cronly等人报道的方法制得[5] ：在2 mL 的离心管中加 0.5 g 全奶(购买于当地超市)和1 mL 乙腈，混合，涡旋30 s；再加入0.25 gNaCl，振荡30 s, 然后在12000 转速下离心10 min，上层有机相转移至另外一个离心管并置于Eppendorf真空干燥器内45 °C干燥。最后用0.5 mL的初始流动相（甲醇/水=10/90）复溶，并用0.2 μm PVDF 过滤针过滤，最终得空白牛奶基质。不同浓度的氯霉素和0.3 ppb（在基质中）的内标d5-CAP逐个加入到一定量空白牛奶基质中。
色谱条件： • 色谱柱：ACE® C18, 50x2.1 mm, 3 μm • 进样体积：10 μL • 流速：0.5 mL/min • 流动相A：水 • 流动相B：甲醇 • 梯度： • 0.00 min 10% B • 0.05 min 10% B • 2.50 min 95% B • 3.00 min 95% B • 3.10 min 10% B • 4.50 min 10% B 质谱条件： • 真空隔层加热电喷雾源（VIP-HESI）加热温度：400 °C • 加热气体流量：70 unit • 雾化气流量：90 unit • 锥孔气温度：250 °C • 锥孔气流量：10 unit • 喷雾电压：-4500 v • 主动排空: 开 • 标准分辨率 • 转换时间：100 ms • CAP 和d5-CAP 检测离子： • m/z 320.9>152 (CE:12 v) 定量 • m/z 320.9>257 (CE: 8 v) 定性 • m/z 320.9>194 (CE:10 v) 定性 • m/z 326>152 (CE:12 v)内标
实验结果图2显示的是空白牛奶基质中加入最低浓度0.02 ppb CAP (上样量为200 fg）的离子流色谱图。在这色谱图中可以观察到有一个微弱的背景信号干扰。然而，这基质干扰峰响应值远小于最低浓度信号强度，0.02 ppb的CAP可以清晰的检测到。图3显示的是0.02 ppb CAP（上样量为200 fg）在空白牛奶基质中三个选择离子监测离子通道MRM的色谱图，它们的S/N都大于10。
结论建立了一种简单，快速测定牛奶中氯霉素浓度的高效液相串联质谱法。利用可以对牛奶基质中浓度低至 0.02 ppb的氯霉素进行准确定性和定量分析。
