化学试剂：丙烯酰胺Acrylamide，C3H5NO，CAS: 79-06-1 建议的内标：D3-丙烯酰胺
色谱流动相的制备：流动相A：在1 L HPLC级的水中，加入10 µL甲酸。 流动相B：在1 L HPLC级的甲醇中，加入10 µL甲酸。
样品制备试剂 ：Carrez ReagentⅠ (三水合亚铁氰化钾) K4Fe(CN)6 • 3H2O。 Carrez ReagentⅡ (七水合硫酸锌) ZnSO4 • 7H2O。
洗脱液的制备： Carrez 试剂Ⅰ：溶解37.5 g K4Fe(CN)6•3H2O于250 mL HPLC级的水中。 Carrez 试剂Ⅱ：溶解 75 g ZnSO4 • 7H2O于250 mL HPLC级的水中。
样品制备 ：基于Buhlert和Hartig等人提出的方法[1，2]： 1. 称量5 mL匀浆的样品； 2. 加入50 mL环己烷 / 丁基甲基醚 ( 95 / 5 ) 混合溶液进行脱脂； 3. 空气干燥； 4. 加入500 µL内标D3-丙稀酰胺溶液 ( 10 µg/mL, 溶解于 HPLC级的水中)，得到内标浓度约为10 ng/mL的溶液； 5. 加入95 mL HPLC级的水，40 ℃超声提取10 min (溶液中加入剪成碎片的过滤纸)； 6. 加入2.5 mL Carrez 试剂Ⅰ和2.5 mL Carrez 试剂Ⅱ，进行蛋白质沉淀； 7. 过滤并离心； 8. 如果需要沉淀完全，将溶液冷却至 -18 ℃，然后迅速暖至室温，离心； 9. 用水稀释上清液(稀释比例1 / 4 , V/V)。
基于Tareke等人提出的方法[3]： 1. 称量10 g匀浆的样品； 2. 加入100 mL水，和100 µL内标 D3-丙稀酰胺 (10 µg/mL，溶解于HPLC级的水中)； 3. 于12 mL Pyrex 玻璃离心管中进行离心； 4. 14000 r/min离心10 min，上清液移入两支Eppendorf管中； 5. 用乙腈活化固相提取柱，然后用水清洗(2×2 mL) (多模式分离，300 mg，International Sorbent Technology 有限公司)； 6. 弃去开始的1 mL滤液； 7. 其他的洗脱液，用0.45 µm 滤膜进行过滤； 8. 用 500 µL超滤器 (Microcon YM-3, Millipore)，14000 r/min 离心10 min进行超滤，接收200 µL滤液。
基于Jürgen Buhlert (CVUA Sigmaringen, 德国) 提出的方法（牛奶基质）： 1. 用5倍的水稀释样品 (V/V)； 2. 加入内标D3-丙稀酰胺 ； 3. 用Carrez试剂Ⅰ和Ⅱ进行蛋白质沉淀； 4. 过滤； 5. 在LC-MS/MS进样前，每1 mL上清液中加入4 µL 甲酸。
色谱分离条件 Agilent 1100 系统：G1312A二元泵系统、G1367A型自动进样器、柱温箱。 色谱柱[2]：1. Phenomenex Luna，3 µm，C18，150 mm×3 mm，基质较简单时推荐使用； 2. Thermo Electron Hypercarb，5 µm，100 mm×3 mm，基质较简单时推荐使用 (例如可可饮料，全麦面包等) 。 流动相：A相—水 + 0.1% 甲酸；B相—甲醇 + 0.1%甲酸。
MS/MS 检测 API 3200™或3200 QTRAP® LC-MS/MS液质分析系统。TurboIonSpray 离子源、正离子方式、MRM扫描 方式。
