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使用高分辨率 LC/MS 对两种利妥昔单 抗生物仿制药的完整质量数、亚基质 量数和游离多聚糖进行比较研究
点击次数：2815 发布时间：2020/5/21 20:10:11
前言 ：近年来，由于多种高利润的原创生物制剂的专利保护期满，生物仿制药单克隆抗体 (mAb) 的开发和生产迅速增长。尽管不存在有关生物仿制药的全球监管标准，但是 业界一致认为生物仿制药应当：(i) 与原创生物制剂具有高度生物物理和生物化学相 似性，并且 (ii) 在纯度、效价和安全性方面具有可比性[1]。美国 FDA 等监管机构指 出，可以使用高质量分析数据来证明范围较窄的体内研究的合理性[2]，强调了全面的 高分辨率分析表征的重要性。 与小分子药物不同，mAb 极其复杂，难以实施完整的分析表征。因此，生物制药 公司将确定一组需要监测的关键质量属性 (CQA)，选择 CQA 的原则是它们对生物制 剂的整体质量、安全性或有效性具有重大影响。由于同一工厂可能生产多种治疗药 物，因此 mAb 身份（鉴定）是一种 CQA，其最有效的测定方法是完整蛋白质质谱 法。此外，糖基化通常也被视为一种 CQA，因为非人类多聚糖基序可能触发急性或 慢性过敏反应[3,4]。另外，由于 mAb 由培养的细胞产生，而多聚糖对培养条件的变化 非常敏感，因此它们是生产工艺发生非预期变化的有用的指标。 本应用简报分析了两种利妥昔单抗生物仿制药的完整质量数、亚基质量数和糖基 化，并将它们与创新药物分子进行了比较。我们使用四种不同的工作流程进行分析： (i) 完整 mAb，(ii) 还原态亚基，(iii) IdeS 酶解的亚基，以及 (iv) 游离多聚糖。在这些 工作流程中，样品前处理时间各不相同，有的无需样品前处理（完整 mAb），有的 需要大约三个小时（游离多聚糖）。包含更多样品前处理步骤的工作流程的优势通常 在于对低丰度多聚糖组分具有更高的灵敏度，从而提高了相应技术的分析能力。
结果表明，由 Agilent 1290 Infinity II 液相 色谱系统和 Agilent 6545XT Q-TOF 组成的 安捷伦高分辨率 LC/MS 非常适合执行这 些分析。此外，利用 AssayMAP Bravo 自 动完成游离多聚糖工作流程中的样品前处 理，从而减少人为错误并缩短样品前处理 时间。标记多聚糖可在小样品量中以高浓 度洗脱，无需冗长的干燥步骤。
实验部分 材料与方法 利妥昔单抗的生物仿制药和创新药物购自 新加坡当地的经销商。二硫苏糖醇 (DTT)、 盐酸胍、甲酸、甲酸铵、乙腈、碳酸氢铵 和 Tris-HCl 购自 Sigma。IdeS 蛋白酶购自 Genovis。所有流动相组分均为 LC/MS 级。 仪器 • Agilent AssayMAP Bravo 系统 (G5542A) ― 仅用于游离多聚糖实验 • Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统， 包括： • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B) • Agilent 1260 Infinity 荧光检测器 (G1321B) ― 仅用于游离多聚糖 实验 • Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
样品前处理 在完整 mAb 实验中，直接分析 10 mg/mL 样品，无需进一步样品前处理。 在还原态 mAb 重链亚基实验中，用新鲜 配制的含有 4 mol/L 盐酸胍的 50 mmol/L 碳酸氢铵 (pH 8.0) 将样品稀释至 1 mg/mL。将样品加热至 56 °C 并保持 60 分钟，冷却至室温后进行分析。 在 IdeS 酶解的 Fc/2 亚基实验中，将 IdeS 蛋白酶复溶于 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) 中，使其浓度达到 2 单位/µL。 用 Tris-HCl 缓冲液将 mAb 样品稀释至 2 mg/mL。然后将 5 µL IdeS 蛋白酶加入 5 µL 的各个 mAb 样品中，30 °C 下孵育 30 分钟，冷却至室温后进行分析。 在游离多聚糖实验中，根据试剂盒随附 的说明，将 AssayMap Bravo 液体处理系 统 (G5542A) 与 Agilent GlykoPrep 快速 N-糖试剂盒 (GPPNG-PC) 配合使用。一 式两份对每种 mAb 样品进行处理，每份 50 µg。经过最终净化步骤后，用 50 µL 的洗脱液洗脱每个样品中的标记多聚糖。 为改善峰形，在分析之前，将 70 µL 乙腈 加入由每个样品得到的 30 µL 标记多聚糖 中。每个样品重复进样三次。
LC/MS 分析 使用 Agilent PLRP-S 色谱柱 (2.1 × 50 mm, 1000 Å, 5 µm) 对完整 mAb、还原态 mAb 亚基和 IdeS 酶解的亚基进行色谱分离。 在每次色谱运行的前一分钟，将液流引入 废液中。对于完整 mAb，样品峰在 2.4 分 钟时洗脱；对于还原态 mAb 亚基，轻链 在 1.8 分钟时洗脱，重链在 2.1 分钟时 洗脱；对于 IdeS 酶解的亚基，Fc/2 在 1.3 分钟时洗脱，而 F(ab＇)2 在 2.1 分钟时 洗脱。 使用 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 (2.1 × 150 mm, 1.8 µm) 对 InstantPC 标 记的多聚糖进行色谱分离。将荧光检测器 设置为 Ex/Em = 285 nm/345 nm，PMT 增益 = 10。表 1 和表 2 列出了所用的参 数。为减少多聚糖在离子源内的碎裂，在 分析之前使用“易碎裂离子”选项进行 SWARM 群集自动调谐。通过比较荧光色 谱图的峰面积对多聚糖进行相对定量。
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