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技术文章
PCR实验注意事项（一）
点击次数：4943 发布时间：2019/3/19 15:01:38
PCR实验注意事项（一）
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1．基础程序
1．基础程序
我们要将 PCR 反应所需的成分充分配置完后，在 PCR 仪上于 90-98℃ 预加热大概几十秒至几分钟，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性－－退火－－延伸三过程，就可获得使模板 DNA 得到充分变性，然后进入扩增温度循环。在每一个循环中，先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般 50-60℃ 之间），特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，一般保持 30 秒钟，使引物与模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分钟（扩增 1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成 DNA ，完成一个循环。重复这样的循环 25～35 次，使扩增的 DNA 片段大量累积。最后，在 72℃ 保持 3-7min ，使产物延伸完整， 4℃ 保存。
2．扩增温度和延伸温度
复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。
3．反应时间
变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。
4．循环次数
循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104～105 数量级时，循环数通常为 25～35 次。
平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低， dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。
5．PCR 反应液的配制
PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
对于使用具 3’-5’ 外切活性的高温 DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和 dNTP ，以及调整体积的 H2O ， B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。
按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决这一问题。将 dNTP 、缓冲液， Mg2+和 primer 先配制好，然后加入一粒蜡珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有当 PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。
PCR实验注意事项（一）
PCR实验注意事项（一）
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
