实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:
1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄为止定量准确,重现性好的定量方法,已得到全的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多域。
四唑蓝,英文名或英文缩写:BT,别:超,50mg/ml,有害品,规格:500毫克
7099N琥珀酰丙酰丙酰脯酰本对硝基酰本胺(20℃)SUCALAALAPROPHEPNA
玻璃酸钠,英文名或英文缩写:wo7ium hyaluronate,别:BR,0.53u/mg,芬末,规格:500u
脲丙基三基烷 N(Triethoxysilylpropyl)urea 2370 40.0 50.0 %溶液100ML 多肽试剂
SOYPEPTONE,GMOFREE,ANIMALFREE大豆蛋白胨,非动物源,非转基因
酸性酯酶染液250克RT
3636克罗米通CrotaMiton
Benzo[b]thiopxene5carboxaldehyde, 2(4,4,5,5tetrametxyl1,3,2 34109
乙酸癸酯 Decyl acetate,≥% 4 100G 通用试剂
甜菊糖/甜菊糖甙/甜菊甙/Stevioside 分析标准品,% 20毫克 国产/进口
Dipxenyl二本醚1克CP,99.5%
808蜂蜡BEESWAX
TMEDA延胡索酸0.25毫升高,99%
N乙基N(3磺丙基... NEthylN(3sulfopropyl)3methylanil... 405804 250MG 通用试剂
基炳醋缩水甘油酯, % Glycidyl Mqthccrylctq;Mqthccrylic ccid 2,3qpoxypropyl qstqr;2Mqthyl2propqnoicccid oxircnylMqthyl qstqr;GMc 101
羊膜细胞;WISH
胚胎膀胱组织来源细胞;CCC-HB-2
NRBF2 Others Human NRBF2 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照)
犬肾细胞系/IgR;MDCK/IgR 恒河猴胚肾细胞,FRhK-4细胞 MV-1-Lu细胞,鼬肺上皮细胞
RLFs, 大鼠肺成纤维细胞
HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/chicken/India/NIV33487/2006) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 细胞裂解液 (阳性对照)
白鲟虹彩病毒探针法荧光定量PCR试剂盒PCR实验方法步骤:
方法
1:在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。产品仅用于科研
2:调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,在72℃ 保7min。
3:伴放线放线杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4:PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。