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公司新闻
小鼠海马神经元细胞分离培养方法
点击次数：471发布时间：2023/8/22 16:53:23
小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。
1.分离培养方法
1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，
2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，
3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，
4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，
5) 过100 μm 滤网，
6) 收集滤液，300 g离心5 min，
7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。
3.免疫荧光
3.1.实验步骤
（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释
破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（多可放置一周）
（5）二抗孵育
室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
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