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公司新闻
Western-Blot实验方案
点击次数：1268发布时间：2022/6/27 9:28:24
实验原理
转移到NC等膜上的蛋白带用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭，加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白—一抗—二抗的位置即将呈现一定的颜色。
实验材料
封闭液(TBST+3%BSA）
漂洗液TBST(10 mMTris-HCI，pH8.0，0.15 M NaCl，0.05%Tween20)；PBS(0.8% NaCl，0.02‰ KCl，0.144% Na2HPO4，0.024% KH2PO4 ，pH 7.4)
辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或II)
I：取 6mg 加入9ml 100mM Tris-HCl(pH7. 6)中，加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl2或CoCl2，过滤去除沉淀，取10μl 30%双氧水与上液充分混匀。注意，此液必须新鲜配制
II：取20mg，溶于20ml冷甲醇中，另取60μl 30%双氧水，混匀。注意，此液必须新鲜配制
碱性磷酸酶显色液：
5%NBT溶液(溶于70%二甲基甲酰胺中) 66μl；
5%BCIP溶液(溶于100%二甲基甲酰胺中) 33μl；
碱性磷酸酶缓冲液(100 mM NaCl，5 mM MgCl2，100 mMTris-HCL，pH9.5) 10ml；
以上三者充分混匀，需要在30min内使用完。
实验操作
1.NC膜漂洗：NC膜用TBST缓冲液漂洗一次。
2.NC膜的封闭：将转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液(液面需盖过胶面)室温下轻轻震荡2-3h。
3.目标靶蛋白与第一抗体的反应：将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定。
4.将封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm2 NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，4℃下轻轻震荡2h。
5.洗膜：反应完毕后，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10min。
6.靶蛋白—抗复合物与二抗反应：
a:将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中，室温下轻轻震荡10min。
此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠
b:将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000。
c:将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0.1ml二抗溶液/cm2膜，封好塑料袋在室温下轻轻震荡1h。
7.剪开塑料袋，取出NC膜，在TBST溶液中冲洗1-5次，每次10min。
8.显色，照相保存结果。
（1）辣根过氧化物酶系统：
a：将膜放入显色液中,室温下轻轻摇动；
b：待条带出现后(约显色1-3分钟),立刻用水洗膜,然后转入PBS中；
c：照相,保存结果。
（2）AP系统
a：将膜放入碱性磷酸酶显色液中，室温下轻轻摇动；
b：待条带出现后(约显色20分钟)，将膜放入200μl 0.5 M EDTA (pH8.0)和50 ml PBS溶液中；
c：照相，保存结果。
