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技术文章
烟草花叶病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
点击次数：3380 发布时间：2022/6/29 9:08:28
| 产品及特点 | 烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群。烟草花叶病和番茄花叶病早为一般所了解。叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形。因此快速灵敏诊断具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的门检测烟草花叶病毒的试剂盒，它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。 2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高。 3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。 4. 特异性高，引物和探针是根据烟草花叶病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。 5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量。 6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。 7. 本产品只能用于科研。 |
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| 规格及成分 |
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| 运输及保存 | 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。 |
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| 自备试剂 | 样品RNA。 |
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| 使用方法 | 一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA段作为阳性对照。 1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。 2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光RT-PCR用模板稀释液，好用带芯枪头，下同）。 3. 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品RNA的制备 7. 如果有N个样品，好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。 8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNAout。 三、Probe qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行） 9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
五、数据处理 12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。 13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。 |
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原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
