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技术文章
单细胞分离试剂盒 (非无菌)
点击次数：3360 发布时间：2022/6/20 9:23:31
单细胞分离试剂盒 (非无菌)
描述：
单细胞分离试剂盒由优化的组织裂解缓冲液和特制的 2.0ml 离心管柱组成。可以快速的 从新鲜动物组织中分离出单细胞，也可用于从甲醛固定的组织中分离细胞核，用于染色体免疫沉淀(ChIP) 。 组织裂解缓冲液适用于大多数动物组织。缓冲液中不含任何蛋白酶和 EDTA，对细胞表面标记物检测无不良 影响。由于使用带孔径的离心管柱技术和特殊的缓冲体系，可从新鲜组织中快速效分离单细胞悬浮液，操 作时间小于 10 分钟， 产量高。 本试剂盒特别适用于淋巴组织如脾脏、胸腺和淋巴结，其他组织样品分离效果 因组织差异而不同 。如果是冷冻或者其他新鲜组织样品推荐使用 进行单细胞分离。.
应用：
分离的单细胞和细胞核可用于 FACS 分析和染色体免疫共沉淀(ChIP) 。单细胞悬浮液也可用于分离/纯 化 DNA ，RNA ，蛋白和其他细胞组份。
试剂盒组分
50T：
1. 25ml Buffer A (用于非固定组织)
2. 25ml Buffer B (用于甲醛固定组织)
3. 50 个离心管柱
4. 50 个收集管
5. 2 根塑料研磨棒
4T：
1. 2.0 ml Buffer A (用于非固定组织)
2. 2.0ml Buffer B (用于甲醛固定组织)
3. 4 个离心管柱
4. 4 个收集管
5. 1 根塑料研磨
储存： 常温运输 ，4℃储存。
所需附加材料
台式离心机
1X PBS 或 FACS 缓冲液 (1XPBS 加入 5%FBS 或 BSA)
胎牛血清 (从非固定组织分离单细胞需要)
1.25M 甘氨酸(从固定组织分离细胞核需要)
37%甲醛(从固定组织分离细胞核需要)
缓冲液的选择：
从新鲜组织中分离单细胞使用 Buffer A。
从甲醛固定的组织中分离使用 Buffer B (固定时间应小于 20 分钟) 。
操作方法：
从新鲜组织(10-40mg)中分离单细胞，试剂盒可以完成 50 次样品分离。
1. 使用在 Buffer A 中加入胎牛血清(实验室自备)， 按每 1ml Buffer A 中加入 100ul 胎牛血清为比例 。将缓冲液 A 和离心管柱套管在冰上预冷。
2. 将组织放入离心管柱套管中，加入 100ul 预冷的Buffer A 到管中，用提供的塑料研磨棒向下按压反复扭转研磨组织 50-60 次 。(注意： 塑料研磨棒是可重复使用的。用蒸馏水底冲洗干 净，用纸巾擦干)
3. 再加入 400ul Buffer A 到离心管柱中，盖上盖子，翻转几次， 1,200Xg，离心 2-3 分钟。
4. 弃掉离心管柱， 涡旋震荡重悬沉淀， 400Xg，离心 5 分钟。弃掉上清液， 沉淀为单细胞沉淀，
可用含有 10-20%BSA 的预冷组织培养基， FACS 缓冲液或其他缓冲液重悬沉淀为细胞悬液。
从甲醛固定组织中分离细胞核用ChIP 实验，本试剂盒可以完成 25 次样品分离。
1. 将 Buffer B 和离心管柱套管在冰上预冷。
2. 称取冷冻或新鲜组织 10-40mg ，用锋利刀片把组织切成小片(1-3 立方毫米)。
3. 将切好的组织放入离心管柱套管中 (标记为离心管套管 A)， 加入 0.5ml 预冷的 PBS 和 14ul
37%甲醛到离心管柱中，盖上盖子，翻转几次，室温下孵育 15 分钟，每 5 分钟翻转几次管 子。
4. 加入 50ul 的 1.25 M 甘氨酸到离心管柱套管中，盖上盖子，翻转几次，室温下孵育 5 分钟。孵育后， 2,000Xg，离心 10 钟，用 0.5ml PBS 清洗组织一次。弃去接收液。
5. 加入 100ul 预冷的 Buffer B 到离心管柱上，用提供的塑料研磨棒按压反复扭转研磨组织 50-60 次(注意：塑料研磨棒是可重复使用的。用蒸馏底冲洗干净，用纸巾擦干)。再加入 400ul Buffer B 到离心管柱套管中，冰上孵育 2-3 分钟， 让较大的未破碎的组织碎片沉下来。
6. 小心的从离心管套管 A 中转移 400ul 上清液到一个新的离心管柱套管中 (标记为离心管柱B)。加入 300ul Buffer B 到离心管 A 中。盖上离心管柱 A 和 B，翻转几次， 2,000Xg，离心 4-5 分钟。 (可选优化： 从接收管中将上清液转移回离心管柱上， 与残留组织匀浆混合， 2,000Xg， 离心 4-5 分钟可以进一步增加产量)。
7. 弃掉 A 和 B 离心管柱， 涡旋震荡重悬沉淀后， 1,200Xg，离心 4-5 分钟。离心后， 弃掉上清，根据下游应用选择合适的缓冲液重悬沉淀(A 和 B 管中沉淀是分离的细胞核)。得到的细胞 核可以用于 ChIP 检测。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
