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技术文章
二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）试剂盒
点击次数：3389 发布时间：2022/6/13 9:25:11
分光光度法50管/24样 测定意义： DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。 测定原理： DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺，在460nm处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算DAO活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体0.6mL×1支，4℃保存。 试剂二：液体6mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3，间隔7，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 测定操作表 对照管 测定管 粗酶液（μL） 250 250 提取液（μL） 640 540 试剂一（μL） 10 10 试剂二（μL） 100 100 试剂三（μL） 100 混匀，37℃水浴30min，1mL玻璃比色皿，对照管调零，测定A460 酶活性计算公式： （1）按样本蛋白浓度计算： 酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr （2）按样本质量计算： 酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。 DAO活性（nmol/min/g）= ×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T= 18×A460÷W （3）按细胞数量计算： 酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每104个细胞每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。 DAO活性（nmol/min/104cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T= 18×A460÷细胞数量 (4) 按液体体积计算 酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。 DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反总÷V样÷T= 18×A460 ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样本体积，0.25mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30min 注意事项： 1、如果OD值小于0.01，适当加大提取用的样本质量； OD值大于0.8，粗酶液可适当稀释，或者减少提取用样本量。 2、样品蛋白质含量需要另外测定。
注 意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
