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技术文章
酸性木聚糖酶（Acidic Xylanase，ACX）测定试剂盒
点击次数：3400 发布时间：2022/6/1 8:20:20
分光光度法50管/24样 注 意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，ACX一般分离自耐酸的真菌，细菌及部分霉菌。 测定原理： ACX在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，进一步在沸水浴条件下与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算ACX活力。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 缓冲液：液体90mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体12mL×1瓶，4℃避光保存。（若出现白色絮状或颗粒状沉淀，可60℃加热溶解后使用）。 试剂二：液体18mL×1瓶，4℃避光保存。 粗酶提取： 1. 发酵液：发酵液于8000g，4℃，离心15min，取上清，作为待测样品。 2. 酶干粉：称约0.1mg，加1mL缓冲液溶解待测。 3. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL缓冲液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清待测。 测定操作表： 对照管 测定管 样品（μL） 200 灭活的样本（μL） （95℃水浴15min） 200 缓冲液（μL） 300 300 试剂一（μL） 200 200 混匀，50℃水浴中反应30min，立即沸水浴中10min灭活。(注意不要让盖子爆开，以免进水，改变了反应体系) 试剂二（μL） 300 300 混匀，沸水浴中显色5min(注意不要让盖子爆开，以免进水改变了反应体系)，1mL玻璃比色皿，540nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。 ACX计算公式： 标准曲线：y = 2.5554x - 0.002 ，R2 = 0.9983 1. 按液体体积活力计算： 酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。 ACX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106 = 435× (ΔA+0.002) 2. 按蛋白浓度计算： 酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。 ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106÷Cpr = 435×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr 3. 按鲜重计算： 酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。 ACX活力（nmol/min/g鲜重）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106÷W = 435×(ΔA +0.002 ) ÷W 150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V反总÷V样=1000µL÷200µL=5； 106：转化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。 注意事项： 1. 吸光度变化应该控制在0.01~0.8之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。 2. 试剂盒2-8℃保存，保质期3个月，建议尽快使用。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
