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技术文章
果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）试剂盒
点击次数：3363 发布时间：2022/5/31 9:01:03
果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。
测定原理：
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存，临用加入2.8mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；
试剂三：粉剂×1支，4℃保存，临用加入260μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；
试剂四：液体16μL×1支，4℃保存，临用加入260μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；
样本的处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤和加样表：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、工作液（可测25个样）的配制：取19mL试剂一和1.26mL试剂二充分混匀；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；
3、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
4、加样表：
| 试剂名称（μL） | 测定管 |
| 工作液 | 800 |
| 样本 | 30 |
| 试剂三 | 5 |
| 试剂四 | 5 |
将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，立即混匀，加试剂四的同时开始计时，记录在340 nm波长下20时的初始吸光度A1和10分20时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：不同匀浆组织中PFK活力不一样，做正式试验之请做1-2只预试，若ΔA>0.5，则说明活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min或5min，使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。
PFK活力单位的计算：
1、血清（浆）PFK活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=450×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=450×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.225×ΔA
V反总：反应体系总体积，8.4×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
