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技术文章
果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)试剂盒
点击次数：3418 发布时间：2022/5/10 8:53:07
分光光度法50管/48样 注 意 ：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 果糖-1,6二磷酸酶又称果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和无机磷，在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。 测定原理： FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算FBP活性。 需自备的仪器和用品： 分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液一：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液二：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用加入40mL试剂四充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存； 试剂二：液体18μL×1瓶，4℃保存；临用加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存； 试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存； 试剂四：液体50mL×1瓶， 4℃保存； 样本的处理： ①总FBP酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体FBP酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆FBP酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中FBP酶活性。 建议测定总FBP酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBP，则按照步骤②提取粗酶液。 测定步骤： 1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、 将试剂一、二、三37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。 3、 加样表： 试剂名称（μL） 测定管 样本 100 试剂二 50 试剂三 50 试剂一 800 将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，立即混匀，加入后一个试剂的同时开始计时，在340 nm波长下记录反应1min后吸光度A1和反应6min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。 FBP活性计算： （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 FBP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.5×ΔA÷W V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
