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技术文章
鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)试剂盒
点击次数：3363 发布时间：2022/5/7 9:10:16
分光光度法50管/48样 注 意： 正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义 脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。 测定原理 鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同时产生NAD，通过检测340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。 自备实验用品及仪器 天平、低温离心机、研钵、紫外可见分光光度计、1mL石英比色皿。 试剂组成和配制 提取液：液体55mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体70 mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用加20mL试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用加20mL试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。 试剂四：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用每瓶加10mL试剂一充分溶解；现配现用。 酶液提取 1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。 2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3，间隔7，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。 3. 液体：直接检测。 测定操作 1. 分光光度计预热30min，调节波长至340nm。 2. 将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。（注意：粉剂试剂需要自行配制） 3. 取1mL石英比色皿，依次加入300μL试剂二，300μL试剂三，300μL试剂四，100μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2，△A=A1-A2。 计算公式 （1）按照样本蛋白浓度计算 酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T =160.77×ΔA÷Cpr （2）按照样本质量计算 酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T =160.77×ΔA÷W （3）按照细胞数量计算 酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 δ-OAT（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T =160.77×ΔA÷细胞数量 （4）按照液体体积计算 酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T =160.77×ΔA V反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
