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技术文章
植酸酶（phytase）试剂盒
点击次数：3415 发布时间：2022/4/24 8:09:21
分光光度法50管/24样 测定意义： 植酸酶（phytase）是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶，它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷，降低粪便中的磷含量，减轻对环境的污染，改善营养成分的吸收和利用，因此具有其广泛的研究和应用价值。 测定原理： 植酸酶在一定温度和pH值条件下，水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物，无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物，在700nm处有特征吸收峰，根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅，超声溶解器，回旋式振荡器。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 缓冲液：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存，临用加缓冲液10mL配制，现用现配；用不完的试剂4℃保存一个月。 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。 显色剂：粉剂×6瓶，4℃保存，临用根据用量每瓶加1mL双蒸水溶解，再加4mL试剂二混匀。 样本处理： 1. 酶制剂：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：500~1000的比例（建议称取约0.001g，加入1mL提取液）加入提取液，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，待测。 2. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，4℃，4000g离心10min，取上清待测。 3. 饲料样品：饲料烘干粉碎，过40目筛，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，4℃，4000g离心10min，取上清待测。 4. 培养液等液体样品，混匀直接测定。 测定操作表： 对照管 测定管 样本（µL） 100 100 37℃温育5min 缓冲液（µL） 400 试剂一（µL） 400 混匀，37℃温育30min 95℃，10min终止反应，冷却至室温 显色剂（µL） 500 500 混匀，37℃静置15min，10000g，室温，离心5min，取上清，蒸馏水调零，测定700nm处吸光值，△A=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。 酶活性计算公式： 标准曲线：y = 0.2764x + 0.0082，R2 = 0.9998；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值。 1． 按照蛋白浓度计算 酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每毫克蛋白每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。 植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.2764÷Cpr÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷Cpr2．按照样本质量计算 酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每克样本每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。 植酸酶活性（μmol/min /g 鲜重）=（△A-0.0082）÷0.2764÷W÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷W 3. 培养液等液体样品 酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。 植酸酶活性（μmol/min /mL）=（△A-0.0082）÷0.2764÷T =0.1206×（△A-0.0082） Cpr：样本蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。 注意事项： 1、显色剂需要临用根据用量配制，每一瓶是10个样本的用量，新配制的显色剂若有颜色则已经污染或者试剂过期，应放弃使用。 2、ΔA线性范围为0.01-2。
注 意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
