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技术文章
亮氨酸氨基肽酶（ LAP）试剂盒
点击次数：3386 发布时间：2022/4/12 8:52:50
分光光度法 50管/48样 注 意 ： 正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： LAP是一类能水解肽链N-末端为亮氨酸的酶，广泛存在于肝、肾、胰等组织中，尤其以肝脏中含量为丰富。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，因此，血清LAP活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。 测定原理： LAP分解L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存； 样本的处理： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 LAP测定步骤： 1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。 2、 将试剂二转移至试剂一中充分溶解（如较难溶解，可50℃水浴加热约30min促进溶解）；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 3、 在微量石英比色皿或96孔板中加入250μL样本和750μL试剂一，混匀后立即记录405nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。 注意事项：若ΔA大于0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。 LAP活力单位的计算： 1、血清（浆）LAP活力的计算: 单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=205.8×ΔA 2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算: （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=205.8×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=0.103×ΔA V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.25 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
