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技术文章
柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒
点击次数：3388 发布时间：2022/4/7 8:10:43
分光光度法50管/24样 注 意：正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。 CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水 试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：液体1mL×1支，-20℃保存； 试剂四：液体55mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用加入2.4mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存； 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： ① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 ② 将匀浆600g，4℃离心5min。 ③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 ④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。 ⑤ 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3，间隔10，重复30次），用于线粒体CS测定。 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）在试剂五中加入1.2mL无水乙醇和26mL试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； （2）测定管：在EP管中加入40μL样本、880μL试剂五和40μL试剂六，混匀，37℃反应15min后立即测定吸光值A1。 （3）对照管：在EP管中加入40μL样本、880μL试剂四和40μL试剂六，混匀，37℃反应15min后立即测定吸光值A2。 （4）计算ΔA=A1-A2，每个测定管设一个对照管。 CS活性计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。 CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W× V样÷V样总）÷T=23.8×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。 CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.0475×ΔA V反总：反应体系总体积，9.6×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
测定原理：
需自备的仪器和用品：
试剂组成和配制：
样本的处理：
测定步骤：
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
