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技术文章
过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒(钼酸铵比色法)
点击次数：3469 发布时间：2022/3/31 9:13:05
100管/96样 微量法100管/96样 测定意义： CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。 测定原理： 过氧化氢能氧化MoO42-成MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键，分子间立即脱水缩合，得到稳定的黄色复合物(H2MoO4·XH2O)n在405nm处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。 需自备的仪器和用品： 酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水 试剂组成和配制： 提取液：液体100 mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃避光保存； 试剂二：液体25 mL×1瓶，常温保存； 试剂三：液体60 mL×1瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至405 nm。 2、在EP管中加入下列试剂 试剂名称（μL） 测定管 空白管 样本 10 试剂一 60 混匀，25℃准确反应2 min 试剂二 200 试剂三 530 530 试剂二 200 提取液 10 试剂一 60 混匀，取200μL于96孔板立即测定A空白和A测定，ΔA=A空白-A测定。空白管只需做一管。 CAT活性计算： 1、标准曲线：y = 0.09x + 0.0013 R2 = 1 x：体系中过氧化氢浓度变化值（μmol/mL） y：吸光值差值ΔA 2、血清（浆）CAT活力的计算: 单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。 CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷V样÷T =444.44×(ΔA-0.0013) 3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。 CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷(V样×Cpr) ÷T =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。 CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V样÷V样总）÷T =444.44×(ΔA-0.0013)÷W V反总：反应体系总体积，0.8 mL；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。 注意事项： 1、 预实验若发现酶活性过高（A测定＜0.1），可用提取液适当稀释样品后测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。 2、 若A空白＜A测定，一方面可能是酶活性过低，可将反应时间2延长到5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重，可将样本稀释5倍左右后测定，并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
