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技术文章
环磷酸鸟苷抗体免疫组化试剂盒
点击次数：2813 发布时间：2024/8/7 9:24:11
产品规格及组成成分：
| 试剂盒成分 | 100 Tests | 存储 |
| 试剂 0：STAT3 | 50ul（1mg/ml） （IHC-P、IHC-F=1:100-500） | -20℃ |
| 试剂 1：1×PBS 缓冲液（干粉，2L） | 2L×4 袋 | 室温 |
| 试剂 2：100×柠檬酸钠抗原修复液 | 32ml | 2-8℃ |
| 试剂 3：内源性过氧化物酶阻断剂（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 试剂 4：抗体稀释液（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 试剂 5：封闭用正常山羊血清工作液（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 试剂 6：生物素标记羊抗兔 IgG（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 试剂 7：辣根酶标记链酶卵白素工作液（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 试剂 8：DAB kit (20×)显色液 | 0.5ml | -20℃ |
| 试剂 9：DAB kit (20×)稀释液 | 0.5ml | -20℃ |
| 试剂 10：苏木素染液（即用型） | 6ml | 室温 |
| 说明书 | 1 份 | - |
样本要求：新鲜活检样本组织，中性福尔马林或多聚甲醛，固定时间 12-48h，参照病理技术规范要求取材、脱水、石蜡包埋并制成蜡块，蜡块在常温条件下保存有效期有 5 年。组织切片厚度为 3-5μm 并黏
附在防脱玻片上，轻拍切片架并用吸水纸吸干组织切片中的水滴，再放入 56-60℃恒温箱中烘烤 2h 后，从恒温箱中移出玻片放在温室下冷却。如果切片在室温下（15-28℃）保存，为了良好的重现组织中的抗原分布情况，请于切片制作后 7 天内完成检测。
实验操作步骤（以石蜡切片为例）
仪器、设备：
移液枪、免疫组化笔、水浴锅、计时器、孵育湿盒、切片架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。
操作步骤
1.脱蜡水化。将石蜡切片置于新鲜二甲苯脱中浸泡 15 分钟，重复三次。去除多余的液体后，依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分钟，蒸馏水（或自来水）冲洗 5 分钟。用 PBS 缓冲液（试剂 1，将干粉溶解于 2L 去离子水中）冲洗切片 5 分钟，重复三次。
2.抗原修复。将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的耐高温塑料切片架上，加适量修复液 1× 柠檬酸钠抗原修复液（试剂 2，将 100×柠檬酸钠抗原修复液加去离子水稀释成 1×柠檬酸钠抗原修复液），液面要浸过切片组织一定高度，将修复盒置于沸水中煮沸修复 15 分钟后取出玻片，自然凉至室温。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
注意：抗原修复时，修复液务必证切片始终浸泡在液体内，一般情况：修复液的量约为 800mL/1 架。
3.阻断内源性过氧化物酶。用吸水纸擦干玻片，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加 50μL 内源性过氧化物酶阻断剂（试剂 3）到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育 30 分钟，用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
4.血清封闭。用吸水纸擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液（试剂 5），37℃封闭 20 分钟，以减少非
特异性染色。
5.一抗孵育。用抗体稀释液（试剂 4）将一抗原液稀释成工作液，用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，滴加适量抗体工作液，置于湿盒 4℃孵育过夜或 37℃孵育 1h-2h。
6.复温。4℃过夜后从冰箱拿出样本，在室温下孵育 15min 复温（抗体孵育为 4℃过夜选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步清洗）。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
7.二抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 生物素标记的羊抗兔 IgG（试剂 6），37℃孵育 20 分钟，用 PBS
缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
8.三抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 辣根酶标记的链酶卵白素孵育（试剂 7），37℃孵育 20 分钟，用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
9. 显色。甩去 PBS 缓冲液，吸水纸擦干切片； 每张切片滴加新鲜配制的 DAB 工作液 50 μL
（试剂 8：试剂 9：试剂 1=1:1:18 比例配置），孵育 3-5min，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深；显色后用自来水冲洗切片终止显色。
10.复染。滴加适量苏木素染液（试剂 10）复染，孵育 1-5 分钟，自来水冲洗 5 分钟，滴加盐酸酒精分化液分化 30 ，自来水冲洗。
11.脱水封片。将玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇，各浸泡 5 分钟， 再将玻片放入二甲苯中浸泡 15 分钟，重复三次。玻片取出来稍晾干，用中性树胶封片。
结果判断
在光学显微镜下对染色的切片观察并判断。苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显色的阳性表达为棕黄色。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
- 速冻组织
- 冰冻切片4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱
- 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，也可根据需要选择其他的固定方式
- PBS冲洗，5分钟×3次
- 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性
- PBS冲洗，5分钟×3次
- 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）
注意事项
1. 检测样本时需同时做阴性对照和阳性对照，否则结果不可取。
2. 本品中的配套试剂，请不要用其他生产商产品替换使用。
3. DAB 为致癌物质，请采取必要的防范措施，现用现配。
4. 本产品限于业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗。
5. 此试剂是否可用于除中性福尔马林或多聚甲醛之外固定的组织未得到验证。
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原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
