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技术文章
人＆各种动物血管内皮细胞分离液实验方法
点击次数：2796 发布时间：2024/8/5 9:19:05
人＆各种动物血管内皮细胞分离液实验方法
【包装规格】
2×200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：
|
| 名称 | 规格 |
| A | 分离液 1 | 200ml |
| B | 分离液 2 | 200ml |
| C | 匀浆冲洗液(赠品) | 200ml |
| D | 组织样本稀释液 (赠品) | 200ml |
| E | 清 洗 液 (赠 品) | 200ml |
| F | 洗涤液 (赠品) | 200ml |
| G | 说明书 | 1 份 |
【实验准备】
1. 适用仪器
大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）
2. 实验分离时间
为获得佳的实验结果，好在取样 2h 内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效 果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
3. 分离液的使用环境
a. 分离液需常温（15℃-25℃) 避光保存，严禁冷藏冷冻保存；
b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 20℃-25℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。
4. 无菌离心管
| 序号 | 产品名称 | 规格 |
| 1 | 无菌玻璃离心管/5mL(随试剂盒附赠 5 支) | 100 支/包 |
| 2 | 无菌硅化离心管/10mL(随试剂盒附赠 5 支) | 100 支/包 |
| 3 | PBMC 高离心管/50ml | 20 支/盒 |
| 4 | PBMC 高离心管/15ml | 5 支/包 |
5. 参考值（目的细胞参考范围）
本试剂盒可证目的细胞的提取率大于 80% ，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃ , 冬季 25℃ 。）的条件下进行。
【血管内皮组织单细胞悬液的制备】
1. 取组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将血管内皮组织剪成小块。
2. 将组织块放在 70µm 细胞筛网(产品编号：TBDTM-SC ，需要另购)上，用研磨器反复揉 搓，边揉搓边加入匀浆冲洗液 (以 0. 1g 组织为例，约加 5-8ml) ，使细胞全部通过筛网 冲到离心管中。
注：需要让细胞形成单个的细胞悬液冲到离心管中，而不是被揉搓研磨挤压到离心管中。
目的：使血管内皮组织形成单个的细胞，而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。
3. 弃去筛网，组织研磨液经 300-400g ，离心 10min ，弃去上清。
4. 用组织样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液细胞浓度调整为 2×108－－ 1×109/ml (以 0. 1g 组织为例，约使用 0.5- 1ml 组织样本稀释液重悬细胞) ，备用。
注：A. 多个动物血管内皮组织需要分离时，应逐个单独进行，不可同时混合进行揉搓研磨。 B. 若发现匀浆冲洗液冲洗的细胞粘度较大，可进行以下处理：
①配置新冲洗液：4 份的匀浆冲洗液加 1 份的胰蛋白酶/EDTA 消化液（产品编号： TE2004Y 需另购）进行稀释，配置为新冲洗液。
②离心管预处理：再研磨开始之，在离心管中加入 0.5-1ml 胎牛血清，进行保护
和终止胰蛋白酶/EDTA 消化液。
③再进行 2,3,4 实验步骤即可。
根据血管内皮组织样本单细胞悬液的量，分以下两种情况：
情况 A：样本细胞悬液量 0.5-1.5ml 时，实验方法如下：
1. 取一支 5ml 无菌玻璃离心管（货号：TUB2016），先加入 2ml 分离液 1，后缓慢加入 1ml 的分离液 2 ，形成梯度界面。再缓慢加入 0.5- 1.0ml 样本细胞悬液。样本细胞悬液小心 加于分离液液界面之上，各液面分层一定要清晰。（分离液总量不得少于 2ml ，样本细 胞悬液不得少于 0.5ml）
或（取一支 10ml 无菌硅化离心管（货号：TUB2015），先加入 3ml 分离液 1 ，后缓慢加入 1.5ml 的分离液 2 ，形成梯度界面。再缓慢加入 0.5- 1.5m 样本细胞悬液。样本细胞悬液 小心加于分离液液界面之上。（分离液总量不得少于 4ml，样本细胞悬液不得少于 0.5ml)
2. 以 450g ，离心 30min 。（注：如改变样本细胞悬液及分离液用量，需相应调整离心力 及离心时间；如使用 5ml 无菌玻璃离心管，可能需要使用 50ml 的 PBMC 效离心管。）
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白 色内皮细胞层 (一层白环及上层 50%分离液 2)。第三层为环状乳白色单个核细胞层(下 层 50%分离液 2 及第二层白环) 。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。第 六层为红细胞和组织细胞碎片层。
4. ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的环状乳白色内皮细胞层转移到新离心管 B 中。
③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 C 中。
5. 向含有内皮细胞的离心管 B 中，加入 5- 10ml 洗涤液（产品编号：TBDTM-W），混匀细 胞。
6. 400g ，离心 10min 。弃去上清。
7. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
8. 250g ，离心 10min ，弃去上清。
9. 重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图
情况 B：样本细胞悬液量 2.0-3.0ml 时，实验方法如下：
1. 取一支 15ml 无菌离心管，先加入 5ml 分离液 1 ，后缓慢加入 2ml 分离液 2 ，形成梯度 界面，再缓慢吸取 2-3ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。
（总液体量不得超过 2/3）。
2. 以 600g ，离心 30min。
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白 色内皮细胞层 (一层白环及上层 50%分离液 2) 。第三层为环状乳白色单个核细胞层 (下层 50%分离液 2 及第二层白环) 。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。 第六层为红细胞和组织细胞碎片层。
4. ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的环状乳白色内皮细胞层转移到新离心管 B 中。
③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 C 中。
5. 向含有内皮细胞的离心管 B 中，加入 5- 10ml 洗涤液，混匀 细胞。
6. 400g ，离心 10min 。弃去上清。
7. 用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。
8. 250g ，离心 10min ，弃去上清。
9. 重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
