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技术文章
WB样品制备大揭秘，不同裂解液，不同方法结果报告出炉！
点击次数：3577 发布时间：2021/9/13 10:01:06
脑组织分离的单细胞（单细胞分离试剂盒Cat#CS-031）
RIPA强/ RIPA /RIPA弱/SD-001 四种
20ul脑细胞分别加入200ul不同裂解液，孵育15分钟，离心10分钟
实验结果：
图中可见，RIPA强，RIPA，RIPA弱三管提取物管底均有明显的白色沉淀团(RIPA不可溶组分），对应裂解液强度不同，RIPA弱沉淀团大，其次为RIPA，再次为RIPA强，SD-001提取物管底无肉眼可见沉淀。
RIPA提取物产生的不可溶组分，再次加入SD-001溶解液裂解后，离心5分钟，RIPA不可溶组分底溶解，无沉淀。
RIPA不可溶组分的进一步研究：
使用RIPA和柱式法SD-001提取小鼠脾脏及肝脏总蛋白，第1道柱式法SD-001,第2道RIPA可溶组分，第3道RIPA不可溶组分再次使用SD-001提取后，进行SDS-PAGE，考染检测结果如下。
Li Q,(2016). Pitfalls of Protein Extraction by RIPA Buffer. BioTechniques 61:327 .doi 10.2144/000114486
经过进一步对沉淀团的研究我们得到了如下结论：
-
RIPA不可溶组分中（3道）含有蛋白
-
所含蛋白具有随机性，不可控性
-
RIPA不可溶组分与可溶组分的蛋白谱有显著差异（非等比）
不同裂解液配方对蛋白的溶出效率有所不同，溶出效率越差，蛋白损失越多，不同的裂解液提取到的蛋白谱有差异，终对下游实验会产生影响。（细胞凋亡，磷酸化检测，激酶活性检测，细胞外基质，WB内参不齐，LC3指标不出等等）
扫码查看案例解析RIPA提蛋白对下游实验有哪些影响
肾脏组织，脑组织
溶液法（RIPA强） 柱式法（SD-001裂解液+离心管柱）
溶液法：15mg组织+150ulRIPA，研磨孵育15分钟，离心10分钟
柱式法：15mg+150ulSD-001裂解液，柱上研磨，离心30
溶液法：提取后有较多的不可溶组分，特别是脑组织样品，难以吸取
柱式法：无明显不可溶组分
BCA检测结果：
得率计算：
| 肾脏 （RIPA） | 肾脏 （柱式法） | 脑 （RIPA） | 脑 （柱式法） | |
| 体积 | 100ul | 130ul | 75ul | 130ul |
| 浓度 | 低 | 高 | 低 | 高 |
| 得率 | 低 | 高 | 低 | 高 |
不同的提取方法所得到的蛋白质量（得率，杂质，蛋白谱）有明显的差异，得率低，杂质多，蛋白谱差异都会影响下游实验，出现结果异常。
PS：
BCA检测时，标曲对照一定要加入裂解液进行检测，以免出现偏差。（我们发现有裂解液加入BCA工作液就变色的情况哦~）
WB样品制备的关键：
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获取大的蛋白质溶解度，减少蛋白质损失以及尽量去除杂质。
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获取给定样品中完整的蛋白质图谱，要真实的反映所有蛋白质种类和比例。获得真实意义上的总蛋白，并非RIPA可溶性组分。
MinuteTM 动物细胞/组织样品总蛋白提取
SD-001/SN-002
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优化的裂解液配方有效解决蛋白溶解度差，丢失蛋白问题，得率更高。
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含变性、天然两款裂解液，应对不同下游实验。
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离心管柱技术，有效去除粘稠物杂质等，让蛋白样品更干净。
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1分钟一管式操作获取真正意义上的总蛋白谱，让蛋白实验赢在起跑线！
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原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
