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技术文章
WB你需要做一次WB设计！
点击次数：3500 发布时间：2021/9/8 9:13:26
做WB实验常常感觉在玩一场“躲猫猫”的游戏，条带不知道跑到哪里去了，怎么找就是不出来！做了很多优化调整，请教了数位师哥师姐，隔壁师姐还是做不好，一直处于“摸瞎瞎”状态，没有进展，这是为什么？ 其实做WB，你需要做一次WB设计！没听错，装修需要设计，WB也需要设计！那如何做这个设计呢？ 一件要做的事情就是知己知彼！ 我们需要了解目标蛋白哪些信息呢？ 目标蛋白的名字 目标蛋白在哪些组织中表达，是否具有特异性 目标蛋白的分子量 目标蛋白在细胞中的表达位置及表达量 是否有相应的抗体 如何获取这些信息呢？重要的方法当然是文献查询（此处省略若干字），文献中查不到的内容怎么办？我们还可以借助信息生物学方法及一些产品信息帮助我们获取信息。 比如维基百科，NCBI，ExPASy等进行查询。 当然还可以利用一些产品信息进行查询。（以下是偷懒的方法，罪过罪过） 了解了目标蛋白以上内容后，我们如何对WB进行设计呢？ 1.先明确好实验目的，为什么要做这个WB实验？要验证哪些问题？ 想证明这个已知蛋白的表达？还是要做目标蛋白在细胞几个不同组分中表达量的对比？或者是进行蛋白定位或研究蛋白转运过程？ 2.明确好实验目的后，根据查询的目标蛋白的表达量情况及细胞定位，确定提取哪部分的蛋白，用什么方法进行提取？ 例如： *目标蛋白表达量不高，且是小分子量蛋白，或是膜蛋白，想证明蛋白的表达，这类蛋白很难提取，容易丢失在RIPA不可溶组分中， 那么就要选择更合适的柱式法进行总蛋白提取。 *目标蛋白在胞质和胞核内均有表达，想验证目标蛋白在两个不同组分中表达量的对比，那就需要进行细胞样品的胞质胞核组分分离，分别用胞质和胞核蛋白组分检测。 *目标蛋白在内质网上，蛋白表达量较低，用总蛋白验证检测条带较弱，需要进行细胞样品内质网蛋白富集后再检测，提高检出效率。 *研究蛋白定位或研究蛋白转运过程，那就需要进行细胞组分分离，那就分别检测细胞核，细胞浆，细胞器，细胞膜，内体等组分。 3.蛋白制备方法考虑好后，要根据目标蛋白分子量及定位选择相应的内参，并确定使用多大的胶进行SDS-PAGE，使用蛋白Marker的分子量范围。 4.根据实验目的，设计对照及上样顺序
例如：做目标蛋白在胞质胞核中表达量对比实验，先我们将胞质和胞核蛋白分离，确定对照组的顺序后，胞质胞核蛋白样品应同时上样到一块胶中，这样证WB所有条件一致，才可说明蛋白表达量的差异和趋势，若在不同胶中，孵育曝光等条件无法统一，得出的结论会导致偏差。另外，做组分分离的实验好加一组Total蛋白，作为对照更为严谨。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
