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技术文章
荧光定量 PCR 实验中的「对照」知多少
点击次数：3863 发布时间：2021/7/15 9:19:11
什么鬼？实验结果又不理想， Ct 值怎么又这么大呢？是哪一步出现了问题呢？
哎哎哎，怎么没有扩增曲线呢？
在您看到荧光定量 PCR 实验结果时，是不是也发出过这样的疑问呢？总感觉哪个实验步骤出现了问题，但又觉得每一步都没问题，真不知该从何下手啊。哎，脑瓜疼，怎么办，怎么办，该怎么办呢？不怕，不怕，「对照」来了，帮您排忧解难。
荧光定量 PCR 实验中，从样本的采集到结果分析包括多个实验步骤，不同的实验步骤可以选择不同的对照进行监控（表格 1）。
表 1. qPCR 实验流程和常见的对照
| 对照种类 | 样本采集 | 样本保存 | 核酸提取 | 逆转录 | 扩增 | |
| 阴性对照 | 无模板阴性对照 | √ | ||||
| 无逆转录酶对照 | √ | √ | ||||
| 阴性样本对照 | √ | √ | √ | |||
| 阳性对照 | 扩增对照 | √ | ||||
| 内部阳性对照 | √ | √ | √ | |||
| 阳性样本对照 | √ | √ | √ | |||
| 内参基因 | √ | √ | √ | √ | √ | |
一、阴性对照
1、无模板对照：
无模板的阴性对照（No Template Control，简称 NTC）是指使用了水代替荧光定量 PCR 反应中的核酸，其他的试剂按比例正常加入，用于监测反应体系中的污染。正常情况下，NTC 孔中不会有扩增；当 NTC 孔出现扩增时，则预示体系中可能有污染。在 SYBR Green 实验中，EZBioscience 分子生物学实验室总结出了容易导致 NTC 出现扩增的两种情况：一是通过观察熔解曲线，如果 NTC 与目的基因熔解曲线峰形不重叠（一般 NTC 的 Tm 值较目的基因 Tm 值小），这种情况下，NTC 的 Ct 值是由引物二聚体造成的，此时可通过优化引物的设计来减少引物二聚体对结果的影响。二是 NTC 与目的基因的熔解曲线峰形重叠（即 NTC 的 Tm 值等于目的基因的 Tm 值），此时需要计算目的基因的 Ct 值与 NTC 的 Ct 值的差值（△Ct）：如果 △Ct ≥ 3，气溶胶的污染程度很低，目的基因的 Ct 值可正常使用；如果 △Ct＜3，说明污染已经很严重了，目的基因的 Ct 值是不能使用的。此时就需要想方设法消除体系中的气溶胶污染。
2、无逆转录酶对照
无逆转录酶对照（No Reverse-Transcriptase Control，No RT）：在进行逆转录实验时，不加逆转录酶，进行逆转录步骤得到的 cDNA 进行后续的荧光定量 PCR 检测。如果检测到扩增，则样本中可能含有未去除干净的基因组 DNA。
EZBioscience®的 EZscript All-in-one Reverse Transcription Kit (with DNase)（货号：RT3），是一款基因组 DNA 去除与逆转录反应在一步进行的新一代快速逆转录试剂盒，包含有设置无逆转录酶的逆转录阴性对照反应所需的 NC Buffer，便于检测 RNA 模板中是否有基因组 DNA 的残留。
3、阴性样本对照
阴性样本对照（Negative Sample Control）是指不表达目的基因的样本，也可以是样本保存液。对阴性样本进行了提取、逆转录和荧光定量 PCR 检测。如果出现扩增，则说明其中的某一个实验过程出现了污染，结合 NTC 的结果，来判断是否样本提取过程中引入了污染。
二、阳性对照
1、扩增对照
扩增对照（Amplification Control）：可使用含有目的基因片段的质粒、假病毒或者基因组 DNA/cDNA 作为扩增阳性对照，监控荧光定量 PCR 的反应体系是否正常。当扩增对照 Ct 值大于预期或者没有扩增，则说明定量 PCR 体系存在问题。2、阳性样本对照
3、内部阳性对照
内部阳性对照（Internal Positive Control，IPC）是指在 RNA 提取，向每个待检测样本中加入特定拷贝数的外源 DNA 或 RNA（不含目的片段），并在荧光定量 PCR 中进行单管多重 PCR，同时检测目的基因和这段序列，进而通过 Ct 值判断对应样品中的核酸富集和扩增效率。4、内参基因
希望通过以上的介绍，大家以后做荧光定量 PCR 实验时能够得心应手，得到好的实验结果，Paper 发发发！
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
