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技术文章
施马伦贝格病毒探针法荧光定量PCR试剂盒使用手册
点击次数：3541 发布时间：2021/7/12 9:44:19
| 产品及特点 | 施马伦贝格病毒（Schmallenberg Virus，SBV）是一种RNA病毒，是一种正本雅病毒属的新病毒，感染症状为发热、腹泻、乏力等，感染此病毒的奶牛产奶量降低，以及新生幼畜出现缺陷等。目还没有发现它能感染人的证据，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的门检测施马伦贝格病毒的试剂盒。 它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。 2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。 3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。 4. 特异性高，引物是根据施马伦贝格病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒 RNA 发生交叉反应。 5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。 6. 本产品只能用于科研。 | ||
| 规格及成分 | 成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 190504a | 500 μL（蓝盖） | |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 190504b | 100 μL（红盖） | |
| 荧光PCR 用模板稀释液 | 180701 | 1 mL（黄盖） | |
| 施马伦贝格病毒探针法qRT-PCR 引物混合液 | 15-90300yw | 100 μL（白盖） | |
| 施马伦贝格病毒qRT-PCR 探针 | 15-90300pb | 50 μL（棕色管） | |
| 施马伦贝格病毒探针法qPCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) | 60908-90300pc | 50 μL（黄盖） | |
| 使用手册 | 15-90300sc | 1 份 | |
| 运输及保存 | 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。 | ||
| 自备试剂 | 样品 RNA。 | ||
| 使用方法 | 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。 2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。 3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 | ||
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| 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 4. 换枪头，在 6 号管中加入5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得1×10E6 拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用 5. 换枪头，在 5 号管中加入5μL 1×10E6 拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用 6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 RNA 的制备 7. 如果有 N 个样品，设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。 8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA 提取试剂盒兼容。也可以向我公司购买柱式病毒RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行） 9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加） | |||
| 成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管（2-7 管） | |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 各10μL | 10μL | 各10μL | |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL | |
| 施马伦贝格病毒 qPCR 探针 | 各1μL | 1 μL | 各1μL | |
| 施马伦贝格病毒探针法 qPCR 引物混合液 | 各2μL | 2 μL | 各2μL | |
| 待测样本 RNA 模板 | 5 μL | - | - | |
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| 超纯水 | - | 5 μL | - | |||||||||||||
| 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） |
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- | 各5μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） | ||||||||||||||
| 11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：
四、数据处理 12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。 4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于35，则为阳性。 | |||||||||||||||||
| 关联产品 | 施马伦贝格病毒可视化 LAMP 检测试剂盒 | ||||||||||||||||
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
