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技术文章
细胞慢病毒转染方法和步骤
点击次数：4765 发布时间：2021/6/18 9:52:13
一、贴壁细胞的转染
1.提一天将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105 个，
2.第二天，待细胞贴壁后，换液，
3.加入1mL培养基，再加20 μL 慢病毒，
4.混匀后继续培养，
5.12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，
6.转染1周后，观察细胞生长情况，中途可以换液，保持细胞的活性,
7.当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。
二、悬浮细胞的转染
1.提一天将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为3×105 个，
2.第二天，换液后加入1mL培养基，再加20 μL 慢病毒，
3.混匀后继续培养，
4.12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，
5.转染1周后，观察细胞生长情况，中途可以换液，保持细胞的活性。
转染（Transfection）是指将DNA或者RNA导入真核细胞中的过程。转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。细胞转染有哪些类型和方法呢？
1）根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。
| 瞬转 | 稳转 |
| 导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上 | 导入的DNA整合到基因组中 |
| 导入的遗传物质不传递到子代； 遗传改变只是暂时的 | 导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是的 |
| 不需要选择性筛选 | 需要选择性筛选出稳定转染的细胞 |
| DNA载体和RNA都可用于瞬时转染 | 只有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身不能稳定地导入细胞中 |
| 导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。 | 单拷贝数或低拷贝数的稳定整合的DNA导致较低水平的蛋白质表达。 |
| 通常在转染后24-96小时内收获细胞。 | 需要2-3周的时间筛选出稳定转染的细胞克隆。 |
| 通常不适合使用具有诱导型启动子的载体的研究。 | 适用于使用带有诱导型启动子的载体的研究。 |
2）根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。
| 转染类型 | 转染方法 | 原理 | 应用 | 特点 |
| 化学转染法 | 磷酸钙法 | 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 | 稳转， 瞬转 | 不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用 |
| 阳离子 | 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 | 稳转， 瞬转 | 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大 | |
| DEAE-右旋糖苷法 | 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 | 瞬转 | 相对简便、结果可重复，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清 | |
| 生物转入法 | 病毒介导法 | 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 | 稳转 | 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等 |
| 逆转录病毒 | 特定宿主 | 但携带基因不能太大细胞需处分裂期，需考虑安全因素 | ||
| 腺病毒 | 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 | 瞬时转染 | 可用于难转染的细胞 | |
| 物理转染法 | Biolistic颗粒传递法 | 将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放表达 | 瞬转 | 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞 |
| 电穿孔法 | 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入 | 稳转，瞬转 | 适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大 | |
| 显微注射法 | 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 | 稳转，瞬转 | 转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 |
二、 脂质体转染法
1、材料
293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素(双抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸盐缓冲溶液)、胰酶/EDTA消化液、转染试剂(TransFast)
2、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD
3、实验步骤
细胞传代
(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸，使细胞分散开。
(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
