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技术文章
小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法
点击次数：3390 发布时间：2021/6/17 8:56:53
海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。
小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。
1.试验所需仪器设备及试剂
（1）仪器
生物安全柜
CO2细胞培养箱
荧光倒置显微镜
高速冷冻离心机
电热恒温鼓风干燥箱
（2）试剂耗材
T25细胞培养瓶
血球计数板
细胞培养孔板
红细胞裂解液
神经元培养基
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）
多聚甲醛（PFA）
DAPI
Triton X-100
山羊血清
NSE
Goat anti-Rabbit lgG（H+L）
Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594
Fluoromount-G荧光封片剂
2.分离培养方法
1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，
2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，
3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，
4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，
5) 过100 μm 滤网，
6) 收集滤液，300 g离心5 min，
7) 用培养基重悬沉淀，铺瓶。
3.免疫荧光
3.1.实验步骤
（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可一次不吸出PBS，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释
破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（多可放置一周）
（5）二抗孵育
室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
3.2.检测结果
（1）细胞免疫荧光鉴定照片
阴性
100X-DAPI 100X-Fluorescence
NSE
100X-DAPI 100X-Fluorescence
（2）检验基本情况：
经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
