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技术文章
血清/血浆游离核酸（DNA/RNA）提取试剂盒说明书
点击次数：3784 发布时间：2021/6/10 9:47:52
血清/血浆游离核酸（DNA/RNA）提取试剂盒
· 可从 3ml 以内的血清/血浆或其它液体样品中提取到高纯度的游离 DNA 和/或游离 RNA。
· 获得的 DNA 和 RNA 产量高、纯度好，可以直接用于高通量测序等分子生物学实验。
· 和同类产品比较，该试剂盒的结合体系多可回收到 515x microRNA。
产品组成:
| 试剂盒组成 | 保存 | 50 次 |
| 蛋白酶 K | -20℃（混匀之后） | 8x20 mg |
| 蛋白酶 K 保存液 | 室温 | 8 x 1.2 ml |
| 游离核酸消化液 | 室温 | 150 ml |
| 游离核酸结合液 | 室温 | 2x150 ml |
| 游离核酸回收液 | 室温 | 20 ml |
| 游离核酸洗涤液 1 | 室温 | 100 ml |
| 游离核酸洗涤液 2 | 室温 | 3x12 ml |
| DNase/RNase-free 水
1 号柱 | 室温 | 10 ml |
| 室温 | 100 个 | |
| 25ml 漏斗 | 室温 | 50 个 |
| 3 号柱 Y(黄色) | 室温 | 50 个 |
| 收集管（2ml） | 室温 | 200 个 |
Note –售出后一年内试剂已经过大量的常规检测来其可操作性。此产品仅供研究并且需要由业人员来使用。试剂盒中的部分试剂是有刺激性的。 请带好手套和防护眼镜。
特性:
· 样品种类: 多 3ml 的血清，血浆，羊水，脑脊液（CSF），尿液等液体样本。
· 纯度: 获得的游离 DNA 和游离 RNA 可以直接用于qPCR ,高通量测序等各种分子生物学实验。
· 片段大小: DNA≥50bp，RNA≥17nt。
· 产量：本试剂盒针对无细胞的游离核酸提取经过优化，总量根据不同的样品个体差异可能会比较大。一般从血清或血浆中提取到的游离 DNA 和游离 RNA 的浓度在 1-100 ng/ml。
· 需要的仪器设备: 水浴锅或者金属浴。微型离心机，负压多联器或立式离心机。
· 操作时间: 一般 30-45 分钟可以处理 10 个样品。样品消化步骤需要 2 个小时。
试剂制备:
1. 使用需要添加1040µl蛋白酶K保存液到蛋白酶K (20mg)里。蛋白酶K的终浓度约为20mg/ml。混匀之后放在-20℃保存
2. 使用需要添加48 ml 95-100%的无水乙醇到12ml的游离核酸洗涤液。
操作步骤:平行提取游离DNA和游离RNA
所有的离心步骤均在≥12，000 x g 的离心力下离心 30 除非特殊说明. 一般常温（20-30℃）进行以下操作步骤。
1. 在≥12，000 x g的离心力下离心样品15分钟来去除细胞杂质和沉淀。
2. 按照每200µl样品（血浆，血清或其他生物液体样品）添加 200µl游离核酸消化液体，放入一个15ml的离心管， 混匀。如果样品体积≥1.5ml，则需要试用50ml的离心管。
3. 按照每200µl样品添加10µl的蛋白酶K溶液，涡旋混匀10，37℃下孵育2小时。
4. 添加1体积的游离核酸结合液到消化的样品中并且涡旋混匀10。（例如400µl结合液到410µl的消化样品中。）
5. 添加1.5倍体积的100%的异丙醇到步骤4中的混合物中，涡旋混匀10。
（例如1.2ml的异丙醇到810µl的混合物中。）
| 样品体积 | 200 µl | 500 µl | 1 ml | 3 ml（） |
| 游离核酸消化液 | 200 µl | 500 µl | 1 ml | 3 ml |
| 蛋白酶 K | 10 µl | 25 µl | 50 µl | 150 µl |
| 涡旋混匀并且在 37℃下孵育 2 小时 | ||||
| 游离核酸结合液 | 400µl | 1 ml | 2 ml | 6 ml |
| 100%异丙醇 | 1.2ml | 3 ml | 6 ml | 18 ml |
| 总体积 | 2 ml | 5 ml | 10 ml | 30 ml |
6. 将 25ml 漏斗套到 3 号柱 Y(黄色)内，连接紧密后放置在负压多连器上。
7. 倒入上述步骤 6 的混合液，打开真空开关使液体通过柱子。确保液体通过柱子并且没有残留液体下流后，关闭真空泵并拔掉连接的 25ml 漏斗。
8. 倒入 600µl 游离核酸洗涤液 1 到柱子上，打开真空开关，让液体通过 3 号柱 Y(黄色)，关闭真空泵。
9. 将 3 号柱 Y(黄色)套在 2ml 收集管上，然后放置在台式离心机上全速离心 2 分钟以去除液体残留，然后将 3 号柱
Y(黄色)套在一个干净的 1.5ml 离心管内。
10. 添加 200µl 的游离核酸回收液到 3 号柱 Y(黄色)中，室温放置 3 分钟，离心，保存滤出液。
| 滤出液：游离 RNA 分离
A1. 添加 300µl 无水乙醇（95-100%）到滤出液中，混匀
A2. 将 1 号柱套在一个新的 2ml 收集管上。
A3. 离心去除滤出液。
A4. 继续步骤 11。 | 3 号柱 Y(黄色)：游离 DNA 分离
B1. 将 3 号柱 Y(黄色)套在一个新的 2ml 收集管上。
B2. 添加 600µl 的游离核酸洗涤液 1，离心去除滤出液。B3. 添加 700µl 的游离核酸洗涤液 2，离心去除滤出液。B4. 重复一次步骤 B3。 B5. 将 3 号柱 Y(黄色)套在一个新的离心管内。
B6. 添加 100µl 的 DNase/RNase-free 水到 3 号柱 Y(黄色)基质上，室温下放置 2 分钟然后离心，去除 3 号柱Y(黄色). B7. 添加 200µl 的游离核酸回收液到上述离心管内，混匀 B8. 添加 300µl 无水乙醇（95-100%）到离心管内，混匀
B9. 将 1 号柱套在一个新的 2ml 收集管上。离心去除滤出液. B10. 继续步骤 11。 |
11. 添加 400µl 的游离核酸洗涤液 1，离心去除滤出液。
12. 添加 700µl 的游离核酸洗涤液 2，离心去除滤出液。
13. 添加 400µl 的游离核酸洗涤液 2 到 1 号柱中，离心 2 分钟去除柱子上残留的液体，将 1 号柱转移到一个干净
的离心管内。
14. 添加 15µl 的 DNase/RNase-free 水到柱基质上，放置 2 分钟然后离心来洗脱游离 DNA 或游离 RNA.
操作步骤:游离DNA和游离RNA共同提取
所有的离心步骤均在≥12，000 x g 的离心力下离心 30 除非特殊说明. 一般常温（20-30℃）进行以下操作步骤。
1. 在≥12，000 x g的离心力下离心样品15分钟来去除细胞杂质和沉淀。
2. 按照每200µl样品（血浆，血清或其他生物液体样品）添加 200µl游离核酸消化液体，放入一个15ml的离心管， 混匀。如果样品体积≥1.5ml，则需要试用50ml的离心管。
3. 按照每200µl样品添加10µl的蛋白酶K溶液，涡旋混匀10，37℃下孵育2小时。
4. 添加1体积的游离核酸结合液到消化的样品中并且涡旋混匀10。（例如400µl结合液到410µl的消化样品中。）
5. 添加1.5倍体积的100%的异丙醇到步骤4中的混合物中，涡旋混匀10。
（例如1.2ml的异丙醇到810µl的混合物中。）
| 样品体积 | 200 µl | 500 µl | 1 ml | 3 ml（） |
| 游离核酸消化液 | 200 µl | 500 µl | 1 ml | 3 ml |
| 蛋白酶 K | 10 µl | 25 µl | 50 µl | 150 µl |
| 涡旋混匀并且在 37℃下孵育 2 小时 | ||||
| 游离核酸结合液 | 400µl | 1 ml | 2 ml | 6 ml |
| 100%异丙醇 | 1.2ml | 3 ml | 6 ml | 18 ml |
| 总体积 | 2 ml | 5 ml | 10 ml | 30 ml |
6. 将 25ml 漏斗套到 3 号柱 Y(黄色)内，连接紧密后放置在负压多连器上。
7. 倒入上述步骤 6 的混合液，打开真空开关使液体通过柱子。确保液体通过柱子并且没有残留液体下流后，关闭真空泵并拔掉连接的 25ml 漏斗。
8. 倒入 600µl 游离核酸洗涤液 1 到柱子上，打开真空开关，让液体通过 3 号柱 Y(黄色)，关闭真空泵。
9. 将 3 号柱 Y(黄色)套在 2ml 收集管上，然后放置在台式离心机上全速离心 2 分钟以去除液体残留，然后将 3 号柱
Y(黄色)套在一个干净的 1.5ml 离心管内。
10. 添加 100µl 的 DNase/RNase-free 水到 3 号柱 Y(黄色)中，室温放置 2 分钟，离心，去除 3 号柱 Y(黄色)。
11. 添加 200µl 的游离核酸回收液到上述离心管内，混匀
12. 添加 450µl 无水乙醇（95-100%）到离心管内，混匀
13. 将 1 号柱套在一个新的 2ml 收集管上。离心去除滤出液.
14. 添加 400µl 的游离核酸洗涤液 1，离心去除滤出液。
15. 添加 700µl 的游离核酸洗涤液 2，离心去除滤出液。
16. 添加 400µl 的游离核酸洗涤液 2 到 1 号柱中，离心 2 分钟去除柱子上残留的液体，将 1 号柱转移到一个干净的离心管内。
17. 添加 15µl 的 DNase/RNase-free 水到柱基质上，放置 2 分钟然后离心来洗脱游离核酸（游离 DNA 和游离 RNA）.
附录1：处理保存在DNA/RNA ShieldTM保护剂中的样品
对于保存在DNA/RNA ShieldTM保护剂(货号TR120)中的无细胞生物样品。采用下述改进的步骤进行操作。
1. 每1ml的DNA/RNA Shield溶液的样品添加25µl的蛋白酶K溶液，涡旋混匀10，37℃下孵育2小时。
（例如：500µl的无细胞体液，500µl的DNA/RNA Shield保护剂，25µl蛋白酶K）
2. 添加1体积的游离核酸消化液到上述消化的样品中并且涡旋混匀10。
（例如1ml游离核酸结合液到1ml的消化样品中）
3. 添加1体积的游离核酸结合液到到步骤2的混合物中并且涡旋混匀10。
（例如2ml游离核酸结合液到2ml的混合物中）
4. 添加1.5倍体积的100%的异丙醇到步骤3中的混合物中，涡旋混匀10。
（例如6ml的100%异丙醇到4ml的混合物中）
| 样品体积(含保护剂) | 200 µl | 500 µl | 1 ml | 3 ml（） |
| 蛋白酶 K | 5 µl | 12.5 µl | 25 µl | 75 µl |
| 涡旋混匀并且在 37℃下孵育 2 小时 | ||||
| 游离核酸消化液 | 200µl | 500µl | 1 ml | 3 ml |
| 游离核酸结合液 | 400µl | 1 ml | 2 ml | 6 ml |
| 100%异丙醇 | 1.2ml | 3 ml | 6 ml | 18 ml |
| 总体积 | 2 ml | 5 ml | 10 ml | 30 ml |
6. 接下来按照主操作步骤的第 6 步进行游离 DNA，游离 RNA，或者总游离核酸进行提取。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
