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技术文章
文库定量试剂盒说明书
点击次数：3611 发布时间：2021/6/7 9:54:39
产品简介
本产品是通过SYBR
Green I嵌合荧光qPCR法进行Illumina
平台下高通量测序文库浓度
测定的用试剂盒。具体的工作原理是以Illumina
P5和P7芯片结合序列为引物，利用试剂盒
提供的6个标准品绘制标准曲线，再根据标准曲线通过绝对定量法来计算待测文库的浓度。
本试剂盒提供了文库定量所需的所有组分，其中的2×Quant MasterMix (SYBR Green)采用
了抗体修饰的热启动型Taq DNA聚合酶，配合添加了H-compete因子和EP组分的qPCR Buffer体
系，使得qPCR预混液具有广泛的样本普适性，同时还具有扩增效率高，检测特异性好、GC含
量适应性广、检测灵敏度高等特点，程度的保障了文库浓度定量的性和重复性。
试剂盒中提供的标准品共分为6个梯度，覆盖区间为20 pM~0.0002 pM，梯度间的浓度
差别为10倍，标准品为线性双链DN段，片段大小为449 bp，GC含量为51.2%。
试剂盒中提供的10×qPCR Primer Mix中的引物是根据Illumina
P5和P7芯片结合序所设
计，包括如下两种引物：
Primer 1： 5＇-AATGATACGGCGACCACCGA-3＇；
Primer 2： 5＇-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3＇。
同时，试剂盒还提供了用于文库样品稀释的10×Library Dilution Buffer，方便客户对文库
样品进行定量的稀释。此外，本试剂盒不但可用于文库样品的定量，还可用于检测实验环
境中文库污染的程度。
试剂盒特点
简便快速：试剂盒提供了用于文库定量的所有试剂，操作简便快速，与上游建库试剂盒兼容
性好；
定量：检测试剂扩增效率高，特异性好，在0.0002 pM~20 pM范围内均有很好的线性关系；
适应广泛：试剂盒提供的qPCR试剂具有良好的GC含量和扩增片段大小普适性。
注意事项 请务必在使用本试剂盒之阅读此注意事项
1、关于移液
(1) 所有试剂在使用需解冻充分，震荡混匀并短暂离心收集液体后再开盖使用；
(2) 尽量避免使用排枪，尽量使用带滤芯的枪头。
2、1×Library Dilution Buffer的准备
用无核酸酶污染的超纯水或者分子生物学别的水来稀释Library Dilution Buffer，不
要用DEPC处理的水或自来水来稀释。可根据实际用量选择Library Dilution Buffer的稀释
量，1×Library Dilution Buffer可在
Green I嵌合荧光qPCR法进行Illumina
平台下高通量测序文库浓度
测定的用试剂盒。具体的工作原理是以Illumina
P5和P7芯片结合序列为引物，利用试剂盒
提供的6个标准品绘制标准曲线，再根据标准曲线通过绝对定量法来计算待测文库的浓度。
本试剂盒提供了文库定量所需的所有组分，其中的2×Quant MasterMix (SYBR Green)采用
了抗体修饰的热启动型Taq DNA聚合酶，配合添加了H-compete因子和EP组分的qPCR Buffer体
系，使得qPCR预混液具有广泛的样本普适性，同时还具有扩增效率高，检测特异性好、GC含
量适应性广、检测灵敏度高等特点，程度的保障了文库浓度定量的性和重复性。
试剂盒中提供的标准品共分为6个梯度，覆盖区间为20 pM~0.0002 pM，梯度间的浓度
差别为10倍，标准品为线性双链DN段，片段大小为449 bp，GC含量为51.2%。
试剂盒中提供的10×qPCR Primer Mix中的引物是根据Illumina
P5和P7芯片结合序所设
计，包括如下两种引物：
Primer 1： 5＇-AATGATACGGCGACCACCGA-3＇；
Primer 2： 5＇-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3＇。
同时，试剂盒还提供了用于文库样品稀释的10×Library Dilution Buffer，方便客户对文库
样品进行定量的稀释。此外，本试剂盒不但可用于文库样品的定量，还可用于检测实验环
境中文库污染的程度。
试剂盒特点
简便快速：试剂盒提供了用于文库定量的所有试剂，操作简便快速，与上游建库试剂盒兼容
性好；
定量：检测试剂扩增效率高，特异性好，在0.0002 pM~20 pM范围内均有很好的线性关系；
适应广泛：试剂盒提供的qPCR试剂具有良好的GC含量和扩增片段大小普适性。
注意事项 请务必在使用本试剂盒之阅读此注意事项
1、关于移液
(1) 所有试剂在使用需解冻充分，震荡混匀并短暂离心收集液体后再开盖使用；
(2) 尽量避免使用排枪，尽量使用带滤芯的枪头。
2、1×Library Dilution Buffer的准备
用无核酸酶污染的超纯水或者分子生物学别的水来稀释Library Dilution Buffer，不
要用DEPC处理的水或自来水来稀释。可根据实际用量选择Library Dilution Buffer的稀释
量，1×Library Dilution Buffer可在
3、文库的浓度和稀释度
文库必须稀释至标准曲线CT值范围内才能进行定量分析。计算浓度时，CT值
范围之外的CT值不可用于计算。若文库只有一个稀释度，则需重新稀释至合适浓度后再次进
行定量；若文库有多个稀释梯度，则可选取落在范围内的CT值进行浓度计算。标准曲线
CT值范围选取方案参见“数据分析部分”。文库稀释可参照过往经验或使用其他测定方
式测定的浓度作为参考进行。下表为可定量文库浓度范围：
浓度类型 范围
摩尔浓度 20 pM~0.0002 pM
质量浓度 5.93 pg/μl~5.93×10-5pg/μl
拷贝数浓度 1.20×107
copys/μl~1.20×102
copys/μl
4、文库的稀释
利用准备好的1×Library Dilution Buffer对文库样品进行稀释，请勿使用水作为稀释
液。高浓度DNA溶液粘稠，DNA分散度较差，要避免直接进行大体积稀释(比如一次性稀释
10,000倍)，推荐进行多次小体积稀释。比如：若需要对文库进行10,000倍稀释，则可将文库
进行两次100倍的连续稀释。文库应该现用现稀释，用完丢弃。qPCR反应之，应将稀释后
的文库和解冻后的DNA Standards置于冰上存放。
5、污染预防与无模板阴性对照（NTC，No Template Control）
(1) 为防止PCR产物污染造成定量结果不、可信度不高等问题，推荐将反应体系配制
区和模板制备区进行物理隔离、使用用的移液器等设备、使用带滤芯的枪头、并定
时对各实验区域进行清洁。
(2) 反应体系配制过程中DNA Standards和不同稀释度文库样品的加入应按照从低浓度至
高浓度的顺序进行，并且每次移液都应更换新的枪头，以避免气溶胶污染。
(3) 每次实验都应进行NTC阴性对照反应，并结合熔解曲线进行扩增特异性和体系污染程
度分析。由于检测引物为P5/P7相关的通用引物而非特异引物，且反复进行文库稀释
和定量时的气溶胶污染无法避免，因此NTC反应出现扩增并且产生CT值应属正
常情况。数据分析时，可先根据NTC起峰情况确定标准曲线CT值范围(方案参见
“数据分析部分”)，再进行标准曲线绘制和文库浓度计算。
6、扩增曲线基线设置
由于标准品1的浓度远高于常规qPCR模板，其CT值会非常小(一般为7~9)。而大部分
qPCR仪器都会默认将3~15循环设置为基线，因此有时会造成标准品1的CT值错误，进而影
响标准曲线的线性关系。手动设置基线为1~3循环可以避免这种情况的发生。
荧光染料SYBR
Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比。例如：两个
300 bp的双链DNA分子产生的荧光强度与一个600 bp的双链DNA分子产生的荧光强度相当。
因此，在进行文库浓度绝对定量时，必须根据标准品DNA的长度(449 bp)和文库平均长度对
文库摩尔浓度进行长度矫正(方案参见“数据分析部分”)。
8、熔解曲线分析
熔解曲线在判断扩增特异性、污染程度分析以及确认标准曲线T值时至关重
要，因此建议客户每次实验都应进行熔解曲线采集步骤。DNA标准品产生的熔解曲线呈现特
征双峰(下图紫色箭头标记)，这种情况是DNA 标准品的不同位置在不同温度下解链而造成，
并不是非特异性扩增产物。此外，3个DNA标准品的浓度高，循环结束时扩增产物过
多，会导致部分产物在Tm值附近无法解链。因此，3个DNA标准品产生的熔解曲线有
时会出现翘尾现象(下图红色箭头标记)，属正常情况。
9、其他定量方法的关系
高通量测序文库有多种浓度测定方式，如光谱测定法(NanoDropTM等)、荧光染料法
(Qubit
、PicoGreen
等)、电泳检测法(2100 Bioanalyzer、TapeStation、LabChip
GX等)、
qPCR检测法等。其中，qPCR检测法因只测定可扩增文库(双端接头完整)，因此测定值与真
实值接近。一般来说，qPCR法测定的文库浓度会比其他方法略低一些，可使用其他方法
粗略测定的文库浓度作为参考，选取合适的文库稀释度进行qPCR法浓度测定。然而，当文
库被过度扩增时(如扩增循环数太多)，也会导致qPCR法测定的文库浓度比其他方法高一些
（非特异性扩增产物的干扰）。此时，若使用其他方法粗略测定的文库浓度作为稀释参考，
会出现文库稀释度不足的情况。
Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比。例如：两个
300 bp的双链DNA分子产生的荧光强度与一个600 bp的双链DNA分子产生的荧光强度相当。
因此，在进行文库浓度绝对定量时，必须根据标准品DNA的长度(449 bp)和文库平均长度对
文库摩尔浓度进行长度矫正(方案参见“数据分析部分”)。
8、熔解曲线分析
熔解曲线在判断扩增特异性、污染程度分析以及确认标准曲线T值时至关重
要，因此建议客户每次实验都应进行熔解曲线采集步骤。DNA标准品产生的熔解曲线呈现特
征双峰(下图紫色箭头标记)，这种情况是DNA 标准品的不同位置在不同温度下解链而造成，
并不是非特异性扩增产物。此外，3个DNA标准品的浓度高，循环结束时扩增产物过
多，会导致部分产物在Tm值附近无法解链。因此，3个DNA标准品产生的熔解曲线有
时会出现翘尾现象(下图红色箭头标记)，属正常情况。
9、其他定量方法的关系
高通量测序文库有多种浓度测定方式，如光谱测定法(NanoDropTM等)、荧光染料法
(Qubit
、PicoGreen
等)、电泳检测法(2100 Bioanalyzer、TapeStation、LabChip
GX等)、
qPCR检测法等。其中，qPCR检测法因只测定可扩增文库(双端接头完整)，因此测定值与真
实值接近。一般来说，qPCR法测定的文库浓度会比其他方法略低一些，可使用其他方法
粗略测定的文库浓度作为参考，选取合适的文库稀释度进行qPCR法浓度测定。然而，当文
库被过度扩增时(如扩增循环数太多)，也会导致qPCR法测定的文库浓度比其他方法高一些
（非特异性扩增产物的干扰）。此时，若使用其他方法粗略测定的文库浓度作为稀释参考，
会出现文库稀释度不足的情况。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
