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技术文章
申克孢子细菌探针法荧光定量PCR试剂盒
点击次数：3633 发布时间：2021/5/24 9:10:11
申克孢子细菌探针法荧光定量PCR试剂盒产品及特点 ：
本产品是根据探针法qPCR原理开发检测申克孢子细菌的产品，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA 模板。
2. 根据申克孢子细菌设计引物和探针，能一性地检测出申克孢子细菌，但不 能检测其他非申克孢子细菌。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 本产品只能用于科研。
6. 本产品足够 50 次体系的荧光定量 PCR。
运输及保存 自备试剂使用方法低温运输，-20℃保存，youx期一年。
运输及保存 自备试剂使用方法低温运输，-20℃保存，youx期一年。
使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。好在门的区域操作。DNA 模板一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 用模板稀释液，好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
申克孢子细菌探针法荧光定量PCR试剂盒二、样品DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有N 个样品，则需要进行N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。三、设置qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做1 次重复，则标记N+9 个PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1 次重复，则标记N+4 个PCR管，其中N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于PCR 阳性对照（用第4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
四、qPCR 反应参数
过程温度时间预变性95℃5 minPCR 反应（40 个循环）95℃15sec60℃1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）
五、数据处理11. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
12. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct 必须大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其Ct 大于或等于35 则为阴性，如果小于或等于30 则为阳性。如果在30-35 之间，则重复一次。重复实验的Ct 值如果大于或等于35 则为阴性，如果小于35，则为阳性。
申克孢子细菌探针法荧光定量PCR试剂盒
四、qPCR 反应参数
过程温度时间预变性95℃5 minPCR 反应（40 个循环）95℃15sec60℃1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）
五、数据处理11. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
12. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct 必须大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其Ct 大于或等于35 则为阴性，如果小于或等于30 则为阳性。如果在30-35 之间，则重复一次。重复实验的Ct 值如果大于或等于35 则为阴性，如果小于35，则为阳性。
申克孢子细菌探针法荧光定量PCR试剂盒
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
