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技术文章
【经验总结】RAW264.7细胞诱导破骨细胞
点击次数：3748 发布时间：2021/5/20 9:19:37
1. RAW264.7细胞来源和培养
（1）收到细胞后：内含的纸条上建议马上/尽快传代，换新的培养瓶和培养液。我的经验是直接将细胞放到培养箱中适应环境数小时或过夜，再传代。培养基是含丙酮酸钠和谷氨酰胺的DMEM。
（2）传代/接种密度要高，1：2 - 1：4。若密度太低，细胞易伸出伪足和突起（分化的巨噬细胞）；当密度较高时，细胞由于空间较小而回缩，保持原来圆圆的形态（单核细胞）。
（3）传代时用吸管或*头轻轻成片吹下（这是好的传代方法），能直接吹下的是贴壁不牢的圆圆的早期单核细胞，可诱导为破骨细胞，收集起来传代；如果剩下些较难吹下的细胞，可以加0.25%胰蛋白酶37度消化3-5分钟或5-7分钟，收集起来传代仍可用；如若还有难消化的细胞，则是贴壁牢固的已分化巨噬细胞，不能诱导为破骨细胞，应舍弃。（RAW264.7细胞中只有部分细胞可以诱导为破骨细胞，即早期的单核细胞。）
（4）所用血清对RAW264.7细胞的分化影响较大，要用好的FBS（很多用的Gibco，我用的BOVOGEN也不错）。
（5）这个细胞增殖较快，培养基消耗快容易变黄，要勤换液。
2. RANKL因子来源：R&D家的好，PeproTech家的也还不错。
3. RAW264.7细胞的传代次数对其能否诱导成破骨细胞至关重要，代数越低，细胞的分化能力越高。代数超过18-20代，RANKL对细胞无效。我用的是5代以内的细胞（收到的细胞算是第1代），诱导效果较好。
4. 细胞接种密度：细胞密度达到定程度后才会融合，不建议延长诱导时间；建议使用96孔板。
5. 培养基pH：偏酸的培养基利于破骨细胞骨吸收，但是不利于破骨细胞存活；偏碱的环境很难诱导出破骨细胞。pH~7.2较好。可添加HEPES增加培养基的缓冲能力。
6. TRAP染色并不是成熟破骨细胞的特异性检测指标，还要看细胞核的数量以及是否具有骨吸收能力（牙质片或磷酸钙涂层的OAAS培养板）。
7. 接板后马上加入RANKL； RANKL诱导3-4天开始出现破骨细胞；5-6天达到峰值，这时要在6-24小时内进行分析，比如TRAP染色，RNA或蛋白提取等。诱导的过程中多关注培养基的颜色，适时换液。
后，如果以上问题都注意了，但是还没有诱导出破骨细胞，可能是RAW264.7细胞不好用了，建议重新购买RAW264.7细胞。
我发现RAW264.7细胞不同代数或不同批次实验诱导出来的破骨细胞在形态和大小上的差异还是很大的，有时很大有时很小，有的是圆圆的，有的是细长的，还有很多分支的，各种奇形怪状都有（我到现在也不知道是为什么）。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
