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技术文章

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)试剂盒说明书

点击次数：3750 发布时间：2021/4/20 9:19:43

正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)试剂盒说明书GAPDH 催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和 NADH 生成 3 磷酸甘油醛、无机磷和 NAD，340nm 处测定 NADH 的减少量可反映GADPH 活性的高低。

需自备的仪器和用品

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。提取液二：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。试剂：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：液体 14uL×1 支，4℃保存； 组织样本的处理
①总 GAPDH 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰
浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体 GAPDH 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 GAPDH 酶活性。
建议测定总 GAPDH 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的
GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。
细菌或培养细胞的处理
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
  1. 工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或 25℃( 其它物种)预热 10 分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
  1. 在试剂三中加入 500μL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
  2. 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本、5μL 试剂三和 190μL 工作液，混匀，加入后个试剂的同时开始计时，记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算

  1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
  1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
  1. 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
  1. 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=2.572×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
  1. 用 96 孔板测定的计算公式如下
  1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr
  1. 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=2572×ΔA÷W
  1. 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=5.144×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL； T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

原创作者：上海雅吉生物科技有限公司

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,  GAPDH)试剂盒说明书

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