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技术文章
siRNA转染使用说明
点击次数：4376 发布时间：2021/3/26 9:56:43
使用说明：
1. siRNA转染：
a. 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-80%。
b. 在进行下述转染步骤，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清和抗生素的完全培养液)。对于LipoRNAi™转染试剂，抗生素的存在不会影响转染效率，也不会在细胞转染后导致细胞毒性。
c. 参考下表，取个洁净无菌离心管，对于待转染的六孔板中每个孔的细胞，加入125µl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium，加入100pmol siRNA，并用枪轻轻吹打混匀；再加入4µl LipoRNAi™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可vortex或离心。配制完成后，室温存放6小时内稳定。
| 96-well | 48-well | 24-well | 12-well | 6-well | 6cm dish | 10cm dish | |
| 无血清培养液或Opti-MEM® Medium | 5μl | 12.5μl | 25μl | 50μl | 125μl | 250μl | 750μl |
| siRNA | 4pmol | 10pmol | 20pmol | 40pmol | 100pmol | 200pmol | 600pmol |
| LipoRNAi™转染试剂 | 0.16μl | 0.4μl | 0.8μl | 1.6μl | 4μl | 8μl | 24μl |
| 加入siRNA后轻轻混匀，加入LipoRNAi™转染试剂后轻轻混匀，室温孵育20min (参考图3，时间不能少于20min)。 | |||||||
| 每孔加入的混合物的量 | 5μl | 12.5μl | 25μl | 50μl | 125μl | 250μl | 750μl |
| 按照上述用量每孔均匀滴加LipoRNAi™转染试剂和siRNA的混合物，直接继续培养，后续无需在数小时后更换培养液 | |||||||
注1：对于六孔板中个孔的细胞，LipoRNAi™转染试剂的用量可以在2-6μl范围内进行适当调节(如果发现有细胞毒性，可以把LipoRNAi™转染试剂的用量在2-4μl范围内进行适当调节)，siRNA用量可以在50-250pmol的范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和LipoRNAi™ (μl)的用量比例为25:1，如有必要可以在10:1-40:1的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为25:1，此时LipoRNAi™的用量相对较少，既经济又高效。佳的转染条件，不同的细胞类型和培养条件有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
注2：siRNA的推荐浓度为20µM，常用的浓度范围为10-50µM。
注3：对于多个孔转染相同数量相同小RNA的情况可以把每个孔所需的LipoRNAi™转染试剂和siRNA按照相应倍数加大用量，然后起混合在同个离心管内，后续混匀后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。
注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。
图3. LipoRNAi™转染试剂与siRNA不同孵育时间对于靶基因下调效果的影响。LipoRNAi™转染试剂与STIM1-siRNA孵育图中所示的时间后转染Hela细胞，48h后收集细胞通过Western blot检测STIM1蛋白的下调效果。Western blot所使用的STIM1抗体(AF2614 Stromal interaction molecule 1 Rabbit Monoclonal Antibody)按照说明书1:1000稀释，二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208) 1:1000稀释。GAPDH为内参。
d. 无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔125µl LipoRNAi™转染试剂-siRNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
e. 继续培养约2天左右后，即可用适当方式检测siRNA对于靶基因的下调效果，例如qPCR、Western、ELISA、报告基因等。
常见问题：
1. 转染效率低：
a. 优化小核酸与LipoRNAi™转染试剂比例，对于难转染的细胞，可适当增加LipoRNAi™转染试剂的用量。
b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的siRNA等小核酸进行转染。
c. 贴壁细胞转染时状态良好，细胞密度达70-80%时才可进行转染，过稀或过密都可能影响转染效率，不同细胞的佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞宜在对数生长期进行转染。
d. 需使用无抗生素和无血清培养液配制LipoRNAi™转染试剂和siRNA等小RNA的混合物。
e. 转染后培养时间不足，而被误以为转染效率偏低。不同细胞转染后至显著表达所需要培养的时间通常为约48小时。
f. 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。
g. 使用传代次数相对较少的细胞，细胞传代次数太多，对转染效率会有定的影响。
h. 如果没有检测到目的蛋白表达水平的变化，应该仔细核对转染用的小RNA等，确保测序结果和读码框完全正确。
i. 如果靶基因的敲减(knockdown)效果欠佳，应该考虑尝试设计不同的siRNA。
2. 出现定程度的细胞毒性：
a. 转染，细胞至少铺板18-24小时。
b. 减少siRNA用量，按照比例减少LipoRNAi™转染试剂。
c. 检查是否转染时细胞密度太低。
d. 检查细胞是否有支原体等微生物污染。
e. 在细胞培养4-6小时之后进行换液。
附录：
常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：
| Multiple Well Plates or Dishes | Single Well Only for Plates | |||||
| Diameter (Bottom, mm)* | Growth Area (cm2)* | Average Cell Yield | Total Well Volume (ml) | Working Volume (ml) | Recommended Volume (ml) | |
| 6 well | 34.8 | 9.5 | 9.5 × 105 | 16.8 | 1.9-2.9 | 2 |
| 12 well | 22.1 | 3.8 | 3.8 × 105 | 6.9 | 0.76-1.14 | 1 |
| 24 well | 15.6 | 1.9 | 1.9 × 105 | 3.4 | 0.38-0.57 | 0.5 |
| 48 well | 11.0 | 0.95 | 9.5 × 104 | 1.6 | 0.19-0.285 | 0.25 |
| 96 well | 6.4 | 0.32 | 3.2 × 104 | 0.36 | 0.10-0.20 | 0.1 |
| 384 well | 2.7 | 0.056 | 5.6 × 103 | 0.112 | 0.025-0.050 | 0.030 |
| 1536 well | 1.63 × 1.63** | 0.025 | 2.5 × 103 | 0.0125 | 0.005-0.010 | 0.010 |
| 3.5 cm dish | 34 | 9 | 9.0 × 105 | NA | 1.8-2.7 | 2 |
| 6 cm dish | 52 | 21 | 2.1 × 106 | NA | 4.2-6.3 | 5 |
| 10 cm dish | 8.4 | 55 | 5.5 × 106 | NA | 11-16.5 | 12 |
| 15cm dish | 14 | 152 | 1.5 × 107 | NA | 30.4-45.6 | 35 |
| 24.5cm dish | 22.4 × 22.4** | 500 | 5.0 × 107 | NA | 100-150 | 120 |
*Diameter ａnd growth area may vary depending on the manufacturer, ａnd the listed sizes are from Corning.
**These wells or dishes are square.
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
