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技术文章
荧光及可视化 RT-LAMP 扩增试剂盒
点击次数：3751 发布时间：2021/2/25 10:35:48
产品及特点 本产品是根据本公司的双染料 RT-LAMP 利技术开发的荧光和可见光双模式检
测试剂盒，它既可以用于荧光 RT-LAMP 扩增及检测，也可以用于可视化 RT-LAMP
扩增及检测，适用于各种针对核酸的快速定性检测。本产品具有下列特点：
1. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可
用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。
2. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
3. 特异性比 RT-PCR 高，因为 RT-LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。
4. 灵敏性可达 10 拷贝/反应以下（随引物而不同），故假阴性率更低。
5. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测
规格及成分 成 份 编号 塑料盒包装
MMLV 逆转录酶（含 RI），200U/μL 60905a 50 μL（黄盖）
4×RT Buffer（含 dNTP） 60905b 250 μL（白盖）
5×荧光及可视化 LAMP MagicMix 200603a 200 μL（绿盖）
Bst DNA 聚合酶 2.0（8U/uL） 200403 50 uL (红盖)
RT-LAMP 阳性对照模板-引物混合物 130923a 20 μL（黄盖）
超纯水 100935 1mL（亮黄盖）
使用手册 200603sc 1 份
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为年。
自备试剂 RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动打开并调到 60-65℃。如果
用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远
远不如 PCR 仪器，所以使用需要用阳性对照和阴性对照（水）做预实验确认可用。
、样品 RNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括个制备阳性对照（制备
时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，起经历提取过程）和个
制备阴性对照（用水替代样品）。后 N+2 个样品起进行 RNA 提取操作，得
到 N+2 个 RNA 样品。
二、合成 1st-strand cDNA
3. 按下表配制 RT 反应体系:
4. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。
5. 37℃保温 5 分钟。对富含二结构的高 GC RNA 模板，可改成 45℃保温 5 分钟。
6. 加入 1μL (=200 U) MMLV 逆转录酶（含 RI），终体积为 20μL。
7. 42℃保温 60 分钟。
8. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为
LAMP 模板使用，不需要纯化。
三、 荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）
9. 反应设置：如果有 N+2 个 cDNA 样品，则好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP
阴性对照和 LAMP 阳性对照各 1 个。在 N+4 个 0.2mL PCR 管中加入下列成分：
10.混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三种方式进
行扩增和检测。
11.如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中
加 30 μL 自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率（如
果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油）。60-65℃保温 90 分钟，肉
眼观察管内液体颜色。
12.如果使用荧光定量 PCR 仪：设为 60-65℃保温 1 分钟/循环， 90 个循环，每分
成分 N+2 个
样品管
LAMP
阴性对照
LAMP
阳性对照
5 × 荧 光 及 可视化
LAMP MagicMix 各 4 μL 4 μL 4 μL
自备 20×引物混合液 各 1 μL 1 μL -
N+2 个样品 cDNA 多 14 μL - -
RT-LAMP 阳性对照
模板-引物混合物 - - 15 μL
Bst DNA 聚合酶 2.0 各 1 μL 1 μL 各 1 μL
超纯水 14 μL -
钟在 FAM 通道采集次荧光信号。
13.如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法荧光读数：
则在扩增和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数（温度设为 60-65℃，1
次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集次荧光信号。注意：测荧光读数必
须在 65℃进行）。扩增反应按 60-65℃，90 分钟进行。
四、 结果分析及解读
14.如果是用普通 PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结
果。将反应管放置在白色背景（如白纸）观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现
蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈
现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何个呈现蓝色，则说明试剂有问题，实
验无效。请跟厂家联系。
15.如果实验有效，则分析 N+2 个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增
阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。
反应结果示例见左图（9 为阴性，10 为阳性）。
16.如果是用荧光 PCR 仪进行扩增，则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒提供的阳性对照
的 Ct 将小于 60，如果大于 60，说明试剂可能失效，需跟厂家联系。无模板阴性
对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 90。如果任何小于 90，则说明试剂或环境被
污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照 Ct 都在正常范围，则
分析样品的 Ct。Ct 小于 60 的判断为阳性，大于 90 判为阴性，在 60-90 之间则
需要重复检测。
17.如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量 PCR 仪
进行终点法荧光读数来判断阴阳性，则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品
扩增后信号增幅应该超过 100%，阴性对照扩增后信号增幅应该低于 50%，否则
实验无效，请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增后荧光读数的
差值。如果扩增后荧光信号增幅低于 50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高
于 100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在 50-100%之间的，则需要重测。
18.当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不致，以实时荧光
LAMP 的数据为准。般可视化结果滞后实时荧光检测结果 20-30 分钟，也就是
说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其反应液的颜色变化般在第
50-60 分钟时才能观察到。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
