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技术文章
细胞培养基本方法
点击次数：3715 发布时间：2021/2/24 10:04:29
肿瘤细胞培养基本方法
)准备和安装过滤器
清洗好过滤器，干燥，放入张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制
1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。
| 培养基 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|
| 培养基 | 品牌 | 货号 |
| D-MEM/F-12 | GIBCO | 12400024 |
| Dulbecco＇s Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose) | GIBCO | 12800017 |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder | GIBCO | 21700075 |
| Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium (IMDM) powder | GIBCO | 12200036 |
| Leibovitz＇s L-15 Medium powder | GIBCO | 41300039 |
| McCOY＇s 5A | SIGMA | M4892 |
| Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) with ribonucleosides ａnd deoxyribonucleosides | GIBCO | 11900024 |
| Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) without ribonucleosides ａnd deoxyribonucleosides | GIBCO | 12000022 |
| Minimum Essential Medium (MEM) powder | GIBCO | 41500034 |
| NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN＇S MODIFICATION (F12K) | SIGMA | N3520 |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO | 31800022 |
| EGF | SIGMA | E9644 |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256-25G |
| MEDIUM 199, WITH EARLE＇S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED | SIGMA | M5017 |
2、 按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
3、 调 pH至7.2左右。
4、 加水至终体积。
5、 在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。
6、 瓶口封好，4℃冰箱贮存。
(三)小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清般做了灭菌处理，但在使用还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。
1、 将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
2、 处理后的血清贮存于4℃。
3、 小牛血清在使用好进行筛选以掌握血清的质量。
(四)生长培养基的配制
除无血清培养之外，各种合成培养基在使用需加入定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
1、培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。
2、按如下比例配制： 基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。
(五)冻存细胞的复苏
1、应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。
2、将解冻后的细胞液在常温条件下，1000rpm离心5分钟。
3、弃上清，用少量培养基将细胞悬起，将细胞悬液转移至事先加入5ml完全培养基的T-25培养瓶中。将细胞混匀后，置培养箱中培养。
(六)传代:
1、贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。
2、悬浮细胞:
般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。
(七)冻存
将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。
(八)注意事项
1、玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;
2、无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;
3、培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存;
4、消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存;
5、培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月次。
6、进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔定的距离，开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面点。
干细胞培养基本方法
MEF P0细胞培养Protocol
复苏：
- 将MEF P0细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
- 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
- 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml，吹打悬浮。
- 轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
- 按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系转移至1个T75培养瓶中培养，加入培养液14 ml。
- 放入37℃培养箱内培养。
- 复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的MEF完全培养液，可以使细胞生长的更好。
传代：
- 待细胞长到90%-100%满时进行传代，般3-4天，具体视细胞生长情况而定。
- 吸除废液。
- 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗遍。
- 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
- 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（般需要1-2 min）。
- 加2.5 ml MEF完全培养液终止消化。
- 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
- 按照1:2-1:3的比例进行传代。
- 放入37℃培养箱内培养。
冻存：
- 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
- 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
- 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
- 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。
冻存液配方：
MEF完全培养液80%，FBS10%，DMSO 10%
- 般地，P0代MEF细胞传至P3代时，可以进行丝裂霉素C（Sigma，M0503）处理。处理过后的MEF细胞不再增殖，可直接作为feeder使用。
- 传至P3代的MEF细胞长至80%以上时，吸出旧的MEF完全培养液，加入含丝裂霉素C（终浓度10 mg/ml ）的新鲜MEF完全培养液（以T75培养瓶为例，加入培养液的体积为10ml ）。37℃培养箱温育处理3小时。
- 吸出培养液，用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂霉素C。
- 消化细胞、细胞计数并冻存。般地，个T25培养瓶铺1´106细胞。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
