当前位置：阿仪网>上海雅吉生物科技有限公司>技术文章>增加PCR特异性
企业档案
会员类型：旗舰版
已获得阿仪网信誉 等级评定
(0 -40)基础信誉积累，可浏览访问
(41-90)良好信誉积累，可接洽商谈
(91+ )优质信誉积累，可持续信赖
阿仪网旗舰版会员：9年
工商认证 【已认证】
最后认证时间：
注册号： 【已认证】
法人代表： 【已认证】
参观次数：7955499
手机网站：http://wap.app17.com/c137908/
旗舰版网址：http://www.yajiml.com
技术文章
增加PCR特异性
点击次数：3648 发布时间：2021/1/11 9:21:46
1、引物设计
细心地进行引物设计是PCR中重要的步。理想的引物对只同目的序列两侧的单序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。
3.设计5＇端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4.避免引物对3＇末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
5.避免3＇末端富含GC。设计引物时保证在后5个核苷中含有3个A或T。
6.避免3＇末端的错误配对。3＇端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7.避免存在可能会产生内部二结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5＇端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二结构的检测。
有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3＇端使用兼并碱基，因为3＇端后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
2、引物退火温度
引物的另个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。表4列出确定引物Tm常用的两种方法。第个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供个估算的Tm值，所有退火温度只是个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
