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技术文章
猪链球菌 2 型三重 PCR 检测方法
点击次数：3720 发布时间：2021/1/4 10:49:04
GB/T 19915.4—2005
猪链球菌 2 型三重 PCR 检测方法
1 范围
本标准规定了猪链球菌2型荚膜基因（cps2）、溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和 orf2这三个毒力基因的三重 PCR 检测技术。
本标准适用于由猪链球菌 2 型致病基因和致病菌株的检测。 2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的新版本。凡是不注日期的引用文件，其新版本适用于本标准
GB/T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。 3.1
猪链球菌 2 型 Streptococcus suis type 2
猪链球菌是属于链球菌属的种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34 及1/2共 35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是种重要的人畜共患病病原菌。 4 测定方法
4. 1 方法提要
挑取可疑细菌培养物菌落，加入PCR反应管中，进行 PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。 4.2 试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682—1992的灭菌双蒸水。 4.2.1 cps2、mrp和orf2 的上下游引物，按合成说明书使用。 4.2.2 Tag DNA 聚合酶。 4.2. 3 琼脂糖∶电泳。 4.2.4 溴化乙锭。
4.2.5 分子量标记∶DL-2000。
4.2.6 TE缓冲液∶10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH 8.0）。
4.2.7 10×PCR缓冲液∶100 mmol/LKCl，160 mmol/L（NH，）2SO，20mmol/L MgSO，，200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1% TritonX-100,1 mg/mL BSA。
4.2.8 电泳缓冲液∶242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100 mL0.5 mol/L EDTA（pH8.0），加蒸馏水至 l O00 mL，使用时 10 倍稀释。
4.2.9 加样缓冲液∶0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。
4.2.10 阳性对照猪链球菌2型 HA9801 株基因组 DNA 模板，阴性对照马链球菌兽疫亚种 ATCC 35246 株和金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 株基因组 DNA 模板。
4.2.11 猪链球菌2型三重 PCR反应混合物。 4.3 仪器和设备 4.3.1 离心机。 4.3.2 DNA热循环仪。 4.3.3 核酸电泳仪。 4.3.4 pH计，
4.3.5 移液器∶10μL、20μL、100μL、1 000μL。 4.3.6 紫外线透射仪或凝胶成像系统。 4.3.7 恒温水浴锅。 4.4 PCR 操作步骤
4.4.1 阳性对照和阴性对照 DNA 模板的提取
分别将猪链球菌 2 型 HA9801、马链球菌兽疫亚种 ATCC 35246株和金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 株接种于5%犊牛血清 Todd-Hweitt 肉汤培养基，37℃摇振培养18h，用革兰氏阳性细菌柱离心式基因组 DNA 小量抽提试剂盒提取 DNA 模板，—20℃保存备用。 4.4.2 PCR 扩增
用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重 PCR反应混合物的 PCR管中，混匀，加入 Taq 酶（2 U/μL）0.7μL，2000 r/min离心10 s，立即进行 PCR扩增;同时设去离子水的空白对照、猪链球菌2型 HA9801株基因组 DNA 模板的阳性对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246 和金黄色葡萄球菌 ATCC 25923株基因组 DNA模板的阴性对照。扩增条件为∶94℃预变性5min;94℃30s， 55℃30 s，72℃40 s，30 个循环;72℃延伸7 min，4℃保存。 4. 4.3 琼脂糖凝胶电泳
在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后加入溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8μL酶切产物加入2 μL5×上样缓冲液，混匀后加入上样孔，80 V 恒压电泳 20 min，紫外线透射检测。 5 结果及判断 5.1 试验结果成立条件
阳性对照 HA9801 株经 PCR扩增出现约 858 bp、387 bp和 316 bp三条条带，去离子水的空白对照、马链球菌兽疫亚种 ATCC 35246 和金黄色葡萄球菌ATCC 25923 株基因组 DNA模板的阴性对照 PCR 产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。 5.2 结果判断
琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线投射下检测，在空白和阴、阳性对照成立的情况下，待检样品只出现 387bp条条带，可判定为猪链球菌2型;待检样品出现约387bp、316bp和858bp三条条带，或出现 387bp和858bp两条条带，可判定为猪链球菌2型致病菌株;待检样品只出现858bp条条带，可判定为非猪链球菌 2 型的致病菌;待检样品不出现条带，结果为阴性。 6 废弃物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。
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原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
