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技术文章
AH109 酵母感受态细胞
点击次数：3349 发布时间：2023/6/2 8:41:57
AH109 酵母感受态细胞
AH109 Chemically Competent Cell
产品规格:10×100 μ l 保存条件： -80℃
| AH109 | 10× 100μl | 保存条件： -80℃ |
| Carrier DNA | 5ug/μl；100 μl | 保存条件 -20℃ |
| PEG/liAC | 5 ml | 保存条件： 4℃ |
基 因 型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
简 要 说 明
AH109 菌株来源于 PJ69-2A 酵母菌株，将 lacZ 报告基因引入 PJ69-2A 诞生了 AH109，此菌株是 Clontech 公司开发 的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与 MATα型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋 白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为: trp1, leu2 ，报告基因为：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1 。AH109 -GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7 。质粒 PGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD(来 自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒 PGADT7 的筛选标志为 LEU ，用于表 达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白 (Prey) 的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N 端1 ~ 174 位氨基酸区段的DNA 结合域 (DNA-BD) 和位于C 端768 ~881 位 氨基酸区段的转录激活域(AD) 。DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS ，并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的 GAL4 活性， 使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合， 形成 bait 融合蛋白 (bait -BD) 和 prey 融合蛋白 (prey-AD) ，如果 bait 和 prey 发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的 相互接近，形成完整的 GAL4 ，从而激活报告基因的转录。AH109 有四个报告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1 ，分别由 三种不同的启动子 (GAL1 ，GAL2 ，MEL1) 启动，这三种启动子只有 GAL4 识别的 17bp 核心区相同，其余部分均不 同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。AngYuBio High5TM 系列 AH109 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保 存三个月，经 PGADT7 质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。
操 作 说 明
1. 取一支无菌的 1.5ml EP 管，依次加入预冷的目的质粒 1-3µg，
Carrier DNA 10µl ，100µl 冰上融化的 AH109 感受态细胞，PEG/LiAc 500µl ，轻轻翻转混匀 6-8 次；
2. 30℃水浴 30min ，每 10min 轻轻翻转混匀 6-8 次；
3. 每支加入 20µl 的二甲基亚砜； (用于提高转化效率)
4. 42℃水浴 15min ，每 5min 轻轻翻转混匀 6-8 次；
5. 12000rpm瞬时离心弃上清，每支加入 1ml 的 YPD Plus 于 30℃复苏 1h； (用于提高转化效率)
6. 12000rpm 瞬时离心弃上清，用 100µl 0.9% NaCl 重悬，涂板，30℃培养 48-96h。
注 意 事 项
1. 感受态细胞好在冰上融化,PEG 溶液在低温环境下会析出，请于常温下全溶解后使用。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。
3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
4. AHA109 酵母菌株对高温敏感，适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完 毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径 受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使 菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培养可见直径 1mm 克隆；涂 SD 单缺平板 29℃，48-60h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平 板 29℃，60-80h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃，80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
