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技术文章
WB实验小能手—样本制备篇
点击次数：3590 发布时间：2020/12/24 10:10:03
蛋白质印迹（Western Blot, WB）又称为免疫印迹（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中分子量大小不同的蛋白分开，然后通过电转移的方法将凝胶中的蛋白定量地迁移并几乎原位复制、固定到固相膜上，再利用抗原、抗体的特异性结合反应，特殊的抗体标记技术以及相应的检测方法，进而对目的蛋白进行定性、相对定量检测的技术。此项技术诞生于上世纪七十年代，近半个世纪以来经久不衰。 WB实验流程分为样本采集，蛋白样品制备，上样，凝胶电泳，转膜，封闭，抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，显色（信号检测）。作为名实验汪是不是近又被虐到体无完肤？天来和大家聊聊应用广泛几乎人人都曾中枪的Western Blot实验—样本采集和蛋白制备的相关知识和技巧。 样本采集和保存 1. 对于动物组织和植物器官，样本较多或取样时间间隔太长则需先将样本放入液氮速冻冷存；若未能及时进行蛋白样品制备，可液氮速冻后，存入-80℃保存约六个月或浸入液氮罐保存约年。 2. 对于细胞和些微生物样本，可去除培养基后，加裂解液制备蛋白样品；若未能及时制备蛋白样品，去除培养基后，将其液氮速冻后保存于-80℃（约个月）或保存于液氮（约三个月）。 3. 所有样本均不建议保存于-20℃。-20℃时，组织、细胞内的水会结晶，细胞活性和组织微观结构会受到伤害，生物大分子受到组织、细胞内多种因素的影响，稳定性可能会降低。 二 蛋白提取 般为了提取到足够的蛋白以及更容易地提取蛋白，需要准备足够量的样本，要求样本量为细胞>106个，组织>30mg，菌体湿重>10mg，植物>100mg，血清>50µL。蛋白提取的原则：低温快速，裂解充分。 下面对些常用样本的蛋白提取过程进行简单描述： 1. 细胞样本 般样本为1×106～1×107个细胞，根据细胞量多少或不同细胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同，般1×106个细胞，加裂解缓冲液100~200µL，具体实验操作时参照以上比例，可进行适当调整。 1) 悬浮细胞：收集培养皿或培养瓶中的细胞，4℃条件下1000~3000rpm，离心3~5min，留下细胞沉淀，去除细胞培养基，然后用预冷的0.01M PBS（即1×PBS）轻洗2次，4℃条件下1000~3000rpm，离心3~5min，去除上清，取用细胞沉淀，按照上述参考比例加入适量裂解缓冲液，吹打混匀，冰上裂解15~30min。 2) 贴壁细胞：直接去除培养皿或培养瓶中的培养基，用预冷的1×PBS轻洗2次，去除PBS，加入适量裂解缓冲，用细胞刮刮下细胞，连同裂解缓冲液起收集，吹打混匀，冰上裂解15~30min。或者还有种方法是直接用细胞刮刮下细胞，连同培养基起收集，后续过程同悬浮细胞；再有种方法，是用胰酶消化细胞后，收集细胞，离心沉淀，用预冷的PBS轻洗细胞沉淀，后续过程同悬浮细胞，但胰（蛋白）酶消化的方法不适用于目的蛋白为细胞膜上的膜蛋白，会造成影响。 2. 组织样本 般动物组织样本，按照1mg组织加入10µL裂解液的比例进行添加，不同的组织蛋白含量也不同，需要调整添加量。去除组织样本上的脂肪（可用预冷的眼科剪、镊子去除）、血液（用预冷的PBS清洗）等杂质，防止造成污染，产生干扰。然后对处理好的样本，加入裂解缓冲液，用预冷的眼科剪在冰上将其剪碎，可以加入钢珠后，高速振荡研磨仪进行破碎。对于骨、肌肉、皮肤、尾巴、韧带组织等或硬度大或韧性强的样本，可以先试着剪碎，再进行液氮研磨后加入适量裂解液。组织样本处理后，冰上放置15~30min。 3. 冰上放置裂解的同时，需要加入适量蛋白酶抑制剂来减少蛋白酶的水解作用，磷酸化蛋白的提取还需要加入蛋白磷酸酶抑制剂。 4. 冰上放置裂解后，建议再进行超声处理，经过超声处理，裂解更充分。 5. 如有特殊的样本或者特殊的目的蛋白，常规方法难以提取，建议查阅相关文献，参照文献上的配方和步骤提取；若后未找到相关资料，可购买商品化的试剂盒。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
