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技术文章
糜蛋白酶测试盒
点击次数：3471 发布时间：2020/12/9 9:13:18
糜蛋白酶（Chymotrypsin）试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。糜
蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上
糜蛋白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手术后伤口愈合，如白
内障摘除。
测定原理：
糜蛋白酶催化 ATEE 水解，产物在 237 nm 有特征光吸收；通过测定 237 nm 光吸收增加速
率，来计算糜蛋白酶活性。
自备仪器和用品：
台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96
孔板(UV 板)、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 20 mL 蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取：
组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。
测定步骤：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 237 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于 37℃水浴中保温 30min。
3. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μL 试剂一，200μL 试剂二，混匀于 237nm
测定 4min 内吸光值变化，记为△A 空白管。（从吸光值稳定增加开始计时）
4. 测定管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μL 粗酶液，200μL 试剂二，混匀于 237nm
测定 4min 内吸光值变化，记为△A 测定管。（从吸光值稳定增加开始计时）
注意：空白管只需要测定一次。
糜蛋白酶活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟催化吸光值增加 1 为一个酶活单位。
糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A 测定管－△A 空白管) ×V 反总÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A 测定管－△A 空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：25℃每克样品每分钟催化吸光值增加 1 为一个酶活单位。
糜蛋白酶（U/g）=(△A 测定管－△A 空白管) ×V 反总÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A 测定管－△A 空白管)÷W
W：样品质量（g）；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体
系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1 mL；V 反总：反
应总体积，220μL=0.22mL； T：反应时间（min），4min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟催化吸光值增加 1 为一个酶活单位。
糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A 测定管－△A 空白管) ×V 反总÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A 测定管－△A 空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：25℃每克样品每分钟催化吸光值增加 1 为一个酶活单位。
糜蛋白酶（U/g）=(△A 测定管－△A 空白管) ×V 反总÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A 测定管－△A 空白管)÷W
W：样品质量（g）；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体
系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1 mL；V 反总：反
应总体积，220μL=0.22mL； T：反应时间（min），4min。
注意事项：
临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
