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技术文章
3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒
点击次数：3562 发布时间：2020/11/20 10:45:34
测定意义
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸 甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子 ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。
测定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油 酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸 光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说
明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸
甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子 ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA
合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。
测定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油
酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸
光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解。
酶液提取
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL
提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500
万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，
总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。
3. 液体：直接检测。
测定操作
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2. 取微量石英比色皿/96 孔板（UV 板），依次加入 100μL 试剂一，20μL 试剂二，10μL 试
剂三，10μL 试剂四，40μL 试剂五，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸
光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A1-A2
计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /g）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /104
cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T
=321.54×ΔA÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：比
色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反
应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /g）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /104
cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T
=643.08×ΔA÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=643.08×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：比
色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：
反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
注意事项
配制好的试剂二、试剂三、试剂四、试剂五 3 天内使用完。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
