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技术文章
活性氧（ROS）化学荧光法试剂盒说明书
点击次数：3840 发布时间：2020/11/19 9:07:03
活性氧（ROS）化学荧光法试剂盒说明书
一、测定原理：
本试剂盒采用的 DCFH-DA(2，7-Dichlorofuorescin Diacetate)探针，是迄今常用、灵敏的细胞内活性氧检测探针。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，会被细胞内的相关酯酶水解为 DCFH（Dichlorofluorescin）。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。当细胞内有活性氧存在时，DCFH 被氧化为强绿色荧光物质 DCF（Dichlorofluorescein），其荧光在激发波长 502nm，发射波长 530nm 附近有最大波峰，其荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。
二、试剂组成及保存（100T-500T）：
1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，-20℃保存。
2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度计测定）
1、单细胞悬液制备：
活性氧（ROS）化学荧光法试剂盒说明书
方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。方法 2、酶消化法：
方法 3、机械法（网搓法）： 2、加入荧光探针：
①、取不进行任何处理的细胞用 0.01M PBS 重悬，设为阴性对照管。阳性对照管：用稀释好的 DCFH-DA 重悬细胞沉淀，同时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。
②、样本管：用稀释好的 DCFH-DA 重悬细胞沉淀，细胞密度一般要求 1×106-2×107/ml。
③、37℃孵育细胞 30min～几小时。通常为 30～60min 即可。
④、收集孵育（探针标记）后的单细胞悬液，1000g，离心 5～10 分钟，去上清收集细胞沉淀，用 PBS 洗涤 1～2 次。离心收集细胞沉淀用于荧光检测；
3、荧光检测：
①、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测；
②、波长设置：激发波长 500(500±15nm)，发射波长 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。
③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度计测定）
1、直接将探针加入培养液中：
活性氧（ROS）化学荧光法试剂盒说明书
①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1： 1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA(终浓度为 10µM)。去除培养液后，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。
②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。
③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。
④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。
⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
⑥、波长设置：激发波长 500(500±15nm)，发射波长 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC
荧光检测条件检测。
⑦、结果以荧光度值示。
2、先收集细胞，制备成细胞悬液后测定
①、细胞收集：
- 贴壁细胞，吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察孔板底
部(瓶底)由半透明(细胞单层连接成片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。
b、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 0.01MPBS 洗涤 2 次，
1000rpm/min，离心 5min，吸净上清，留细胞沉淀用于测定。
c、悬浮细胞按照常规方法离心(2000rpm/min，离心 5min)，收集细胞沉淀，用无血清培养液或者0.01MPBS 洗涤 2 次，1000rpm/min，离心 5min，吸净上清，留细胞沉淀用于测定。
②、细胞重悬：细胞密度一般要求 1×106-2×107/ml，一般有两种方法：
a、先加入无血清培养液或者 PBS 重悬细胞，然后根据加入培养液或者 PBS 的体积，按照 10µM的初始浓度(做预实验确定自身样本适合浓度)加入探针，
b、先按照 10µM 的浓度将探针用无血清培养液或者 PBS 先稀释好，然后用稀释好的探针重悬上述细胞沉淀，制备成细胞悬液，
③、取一份不加探针，只加入培养基或 PBS 的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞悬液，同时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～ 100µM。
④、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关；每隔 3-5 分钟颠倒混匀一下，使探针与细胞充分接触。
⑤、收集孵育（探针标记）后的单细胞悬液，1000rpm/min，离心 5min，吸净上清，用 PBS 洗涤
1～2 次，离心收集细胞沉淀物用于荧光检测。
⑥、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测。
⑦、波长设置：激发波长 500(500±15nm)，发射波长 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC
荧光检测条件检测。
⑧、结果以荧光度值表 活性氧（ROS）化学荧光法试剂盒说明书
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
